磁性纳米颗粒的制备及其在E.coli O157∶H7核酸检测中的应用

摘要

磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）作为一种新型的功能材料在近几十年来得到了充分的发展。特别是磁性复合粒子，它具有尺寸较小、比表面积大、表面活性高、生物相容性和流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下快速响应等优良特性。目前，在生物医学领域中应用广泛，给功能材料的研发带来了新的发展方向，也为生物分离和检测方法提出了新的思路。另外，化学发光具有安全、灵敏度高，线性范围宽等特点，为病原体检测提供了一个良好的平台。本论文的主要内容是以不同的方法制备磁性纳米粒子并以E.coli O157：H7和E.coli O157：H19为检测对象，结合磁分离技术、化学发光、PCR双重扩增的优点，建立了快速、灵敏和实用的多靶点检测新技术。具体内容包括：
　　 1.以亚麻酸为改性剂的磁性纳米颗粒的制备
　　 传统细微乳液聚合法制备磁性纳米颗粒的过程中，一般采用油酸为改性剂。在实验中我们发现，通过油酸（oleic acid，OA）和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-Methacryloxypropyltrimethoxysilane，MPS）作为Fe3O4表面改性剂时，与甲基丙烯酸甲酯（methylmethacrylate，MMA）聚合耗时长，聚合过程中Fe3O4破乳团聚严重，有结块产生，包埋有单体的磁性颗粒产率低，而且修饰过程中有毒性。α-亚麻酸（α-Linolenic Acid，LNA）比OA多两个双键，更容易聚合，只需要5 h聚合时间，且无毒无害。我们首次用LNA同时作为Fe3O4表面改性剂和与MMA的交联剂，成功合成了聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）包埋的MNPs-PMMA/（LNA/Fe3O4）MNPs，并在其表面上修饰SiO2，得到了SiO2/（PMMA/LNA/Fe3O4）MNPs。由结果可知。制备出的MNPs具有明显的核壳结构，平均直径为500 nm，且为圆颗粒，大小比较均一，具有超顺磁性，饱和磁化强度为1.7374 emu/g。
　　 2.软模板法制备SiO2/Fe3O4磁性纳米颗粒
　　 以改进的软模板法制备Fe3O4微球并制备出了磁含量较高的SiO2/Fe3O4复合磁性颗粒。研究了反应时间和反应物对产物形貌的影响。结果表明，反应时间为12 h和反应物为NH4Ac时得到的产物形貌均匀且表面光滑，平均粒径约为300 nm，饱和磁化强度为78.505 emu/g。SiO2/Fe3O4磁性纳米颗粒的粒度范围为400-500 nm，且为圆颗粒，大小比较均一，具有超顺磁性，饱和磁化强度为43.274 emu/g。
　　 3.基于MNPs和化学发光检测较长双链DNA的条件优化
　　 以E.coli O157的特征基因为检测对象，设计了一种新的基于磁分离、PCR扩增和化学发光的核酸检测方法：将编码O157抗原基因rfbE的探针修饰固定在自制MNPs上。通过掺入生物素标记单体，利用PCR（Polymerase chain reaction）对样本DNA进行标记扩增，扩增的DNA片段与修饰在MNPs上的探针杂交后，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，与修饰有ALP的链亲合素（ALP-Streptavidin，ALP-SA）结合，洗涤后加入AMPPD，通过读取化学发光强度，实现E.coli O157的快速分析鉴定。实验最佳条件为：SA修饰MNPs的最佳浓度为1 mM；探针固定在MNPs上的最佳时间为12 h；杂交最佳时间为30 min；每mg MNPs上结合400 pmol探针时化学发光值最高。
　　 4.基于磁性纳米颗粒富集、生物素信号放大和化学发光的DNA检测新方法的建立及应用
　　 以E.coli O157：H7的特征基因为检测对象，在3中所述方法的基础上引入多重PCR扩增，方法如下：分别将编码O157抗原基因rfbE的探针和H7鞭毛抗原基fliC的探针修饰固定在MNPs上。通过掺入生物素标记单体，利用多重PCR（Multiplex polymerase chain reaction）对样本DNA进行标记扩增，扩增的DNA片段分别与修饰在上述两种MNPs上的探针杂交后，实验过程同3所述，实现了同时对E.coli O157：H72个靶点的快速分析鉴定。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 前言

1.2 磁性纳米颗粒的制备及表面修饰

1.2.1 磁性纳米颗粒的制备

1.2.2 磁性纳米颗粒的表面修饰

1.3 磁性纳米颗粒与生物分子的偶联方法

1.3.1 表面氨基化偶联

1.3.2 表面羧基化偶联

1.3.3 表面醛基化偶联

1.3.4 表面巯基化偶联

1.4 E.coli O157:H7的分子生物学检测方法

1.4.1 实时荧光PCR技术

1.4.2 基因芯片技术

1.5 化学发光分析技术在核酸分析中的应用

1.5.1 化学发光均相核酸探针技术

1.5.2 化学发光异相核酸探针技术

1.5.3 化学发光Southern和Northern印迹杂交技术

1.6 本研究的目的和意义

1.6.1 现有细微乳液法制备MNPs的方法改进

1.6.2 改进的软模板法制备SiO2/Fe3O4

1.6.3 基于MNPs富集、生物素放大和化学发光的核酸检测新方法的建立

参考文献

第二章 细微乳液法制备SiO2包被聚合物MNPs

2.1 前言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 实验试剂与仪器

2.2.2 试验方法

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 PMMA/(OA/Fe3O4)和PMMA/(LNA/Fe3O4)的制备

2.3.2 SiO2包被MNPs的透射电镜图

2.3.3 SiO2包被MNPs的扫描电镜照片

2.3.4 SiO2包被MNPs的FT-IR光谱图

2.3.5 SiO2包被MNPs的磁滞回归曲线

2.4 本章小结

参考文献

第三章 软模板法制备SiO2/Fe3O4磁性纳米颗粒

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 方法

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 Fe3O4磁性纳米颗粒

3.3.2 反应时间对产物形貌和大小的影响

3.3.3 反应物对产物形貌和大小的影响

3.3.4 SiO2包被MNPs的电镜图

3.3.5 磁性纳米颗粒的粒径分析

3.3.6 磁性纳米颗粒的FT-IR光谱图

3.3.7 磁性纳米颗粒的磁滞回归曲线

3.4 本章小结

参考文献

第四章 基于磁分离和化学发光的E.coli O157:H7双重PCR检测方法研究

4.1 前言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 扩增序列的凝胶电泳图片

4.3.2 最佳羧基化浓度修饰实验

4.3.3 最佳探针修饰浓度实验

4.3.4 最佳探针修饰时间实验

4.3.5 最佳杂交时间的实验

4.3.6 以两种复合颗粒为载体检测rfbE特异性片段的效果比较

4.3.7 基于羧基化MNPs的化学发光法在双重扩增检测中的应用

4.4 本章小结

4.4.1 基于磁分离和化学发光的核酸检测新方法的建立

4.4.2 基于MNPs和化学发光检测E.coli O157的条件优化

4.4.3 基于MNPs的化学发光法在双重扩增检测中的应用

参考文献

第五章 总结与展望

附录

致谢