靶向大鼠OPN基因的siRNA表达载体的构建与鉴定

摘要

目的：
　　 通过构建靶向大鼠骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）基因的RNAi载体，并转染原代培养的血管平滑肌细胞，检测并鉴定OPN基因RNAi表达载体在血管平滑肌细胞中介导的基因沉默效应，为后续研究提供有力的工具，为实现冠状动脉旁路移植术后桥血管再狭窄的基因治疗提供新的手段。
　　 方法：
　　 1.采用组织贴块法进行大鼠胸腹主动脉血管平滑肌细胞的原代培养，胰酶消化法传代，液氮冻存，并应用倒置相差显微镜和SP法免疫组化染色对细胞进行鉴定。
　　 2.通过在Gene Bank中检索的大鼠骨桥蛋白的mRNA序列，依据相关原则，设计表达OPN基因siRNA片断的基因序列，化学合成DNA寡核苷酸，经过退火、酶切、连接、扩增等方法构建表达OPN基因siRNA片断的质粒载体。并通过免疫荧光技术检测其转染效率。
　　 3.设计并合成能转录OPN基因RNAi片断的DNA序列，进而通过穿梭质粒构建、转染效率检测、病毒包装等步骤完成靶巴向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒表达载体的构建。进一步通过免疫荧光技术检测其对血管平滑肌细胞的转染效率。
　　 结果：
　　 1.血管平滑肌细胞培养显示，85％的组织块接种存活，显微镜下细胞呈典型的“谷峰状”生长，SP法免疫组化染色鉴定显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白表达阳性。
　　 2.大鼠OPN基因特异性RNAi质粒载体构建成功，但其对离体C6细胞的转染效率不足10％。
　　 3.靶向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功，其对血管平滑肌细胞的转染效率达到70％。
　　 结论：
　　 1.应用组织贴块法简便易行，短期内可获得大量符合后续试验要求的血管平滑肌细胞。
　　 2.利用pMDTM19-T vector可成功构建出符合所设计的目的基因的RNAi质粒表达载体，但细胞转染实验证实，大鼠OPN基因特异性RNAi质粒表达载体对离体细胞的转染效率低下，无法用做进一步实验的有效RNAi表达载体。
　　 3.靶向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒表达载体，经测序鉴定构建成功。通过免疫荧光技术半定量检测慢病毒载体对VSMC的转染效率，取得满意的效果。

目录

文摘

英文文摘

英文术语注释表

绪论

文献综述

第一章 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

1. 材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

第二章 大鼠OPN基因特异性RNA干扰质粒的设计与检测

1. 材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

第三章 靶向OPN基因的siRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

1. 材料

2. 实验方法

3. 结果

4. 讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介

后记