miR-315通过靶向dfmrl来调节突触发育和功能

摘要

脆性X综合症(fragile X syndrome,FXS)是最常见的遗传性智力低下疾病之一,由FMR1基因突变致使脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)功能缺失所致。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的单链RNA,其在转录后水平调控基因表达。近年的研究表明FMRP和miRNA调控通路之间在基因调控水平存在相互作用:一是,FMRP可以与特定的miRNA结合,进而将miRNA募集到FMRP靶标mRNA上,调节其靶标mRNA的翻译；二是,FMRP可以与Dicer相互作用,调节由pre-miRNA生成成熟miRNA的过程。对于FMRP是否会受到miRNA的调控,目前还没有文献报道。对这种作用机制的研究可以为脆性X综合症的分子发病机制提供更为深入的了解。
　　 本文以dFMRP为出发点,寻找能够调控dFMRP的miRNAs,从而进一步研究dFMRP受到miRNAs调控后,对果蝇生长发育的影响。
　　 首先,通过生物信息学预测,我们发现果蝇中存在多种miRNAs可以调控dfmr1,其中miR-315与dfmr13’UTR配对效果最好,调控dfmr1的可能性较大。研究发现miR-315在黑腹果蝇(D.melanogaster)的胚胎、幼虫、成虫中持续表达,且主要表达在大脑和腹神经索(VNC)。果蝇S2细胞内的结果显示,miR-315对dfmrl存在明显的调控作用。利用GFP传感器(GFP Sensor)实验,在果蝇体内水平进一步证实miR-315可以直接作用于dfmr1的3'UTR。经免疫染色实验证明,miR-315在体内可以抑制dFMRP的表达。
　　 其次,通过UAS／Ga14系统,在果蝇体内过表达miR-315会导致果蝇幼虫发育异常,停留在蛹前期不再发育。
　　 进一步研究,我们发现在果蝇幼虫神经肌肉接头(NMJ)部位,miR-315的过表达会引起mini-bouton数量增加、bouton area增大,与dfmr1突变体表型一致,但在branchnumber和bouton number方面未出现与dfmr1突变体类似表型。通过对NMJ的细胞骨架研究,我们发现当miR-315过表达时果蝇幼虫NMJ的细胞骨架中出现了空泡样结构(Futsch+loops)分布无序且增多的现象,在dfmr1突变体中我们也观察到了同样的变化。
　　 在突触功能方面,我们发现在miR-315过表达的情况下,mEJP的频率与对照相比明显增加,说明miR-315通过调控dfmr1影响了突触囊泡的释放。我们进一步研究了导致这种突触囊泡释放加快的机制,发现突触活性中心(Activezone)没有异常,但是突触囊泡的数量出现上升。说明mEJP频率的增加是由于突触囊泡的数量上升所导致。
　　 通过对miR-315调控dfmr1的研究,我们发现在miR-315过表达的情况下,果蝇幼虫出现了一系列的发育异常和NMJ结构上的改变,NMJ的突触功能也出现了变化,使我们对miRNA在脆性X综合症中的作用有了初步了解,对脆性X综合症的诊断和治疗也将提供一定的参考。