卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

摘要

该研究采用醋酸泼尼松龙诱导建立卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia,PCP)大鼠模型,获得实验所需的基本材料.以随机引物法制备地高辛标记的非放射性探针,采用斑点杂交检测大鼠模型肺组织和患者临床标本中的卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii,Pc)DNA.1.PCP大鼠模型的建立、Pc检测及实验标本的采集;采用SD大鼠,醋酸泼尼松龙腹股沟皮下注射2个月,诱导建立PCP动物模型.结果:病原学检查结果显示成功建立了PCP动物模型.检测结果显示,吉氏染色检出率为80﹪,快速银染检出率为50﹪,PCR检出率为95﹪,后者明显高于吉氏染色和快速银染法.PCP动物模型的诱导成功及肺组织的获得为后续的实验研究奠定了基础.2.Pc特异性目的基因的获得及序列测定;以Wakefield等设计的PAZ102-E和PAZ102-H为引物,采用常规PCR扩增Pc的线粒体核糖体RNA大亚基(LSU mt rRNA)基因.结果:测序结果显示所得基因片段长为357bp,与GeneBank中的已有序列比对,结果显示所得基因与Sinclair等公布的Pc LSU mt rRNA基因的同源性为99﹪,故确认是Pc特异的基因.以获得的Pc特异性DNA为模板,采用随机引物法制备地高辛标记的非放射性探针.以已知浓度的地高辛标记的DNA为参照确定探针的浓度,随后检测该探针的特异性和敏感性.结果:实验中所得探针浓度为30ng/ul,显色敏感性为1pg,杂交敏感性为2pg,特异性检测显示该探针不与小鼠伯氏疟原虫、人恶性疟原虫、弓形虫、正常人白细胞和正常宿主(大鼠)肺组织DNA反应,仅与PcDNA反应,杂交后显色出现紫红色斑点.将该探针用于斑点杂交检测大鼠模型肺组织中的Pc,检出率为73.7﹪,肾移植并发PCP患者的BAL标本中未检测到PcDNA.将这些标本采用PCR扩增后结合杂交重新检测,检出率为94.7﹪,在肾移植并发PCP患者的BAL中检出PcDNA.

目录

前言

第一部分卡氏肺孢子虫肺炎动物模型的建立、检测及实验标本的采集

第二部分卡氏肺孢子虫特异性基因片段的获得及序列测定

第三部分卡氏肺孢子虫特异性DNA探针的制备及其实验应用

小结

参考文献

致谢

综述：卡氏肺孢子虫肺炎实验诊断研究进展

摘要

1病原学诊断

2免疫学诊断

3分子生物学诊断

4其它检查

参考文献

在校期间发表的文章及文摘