普鲁士蓝纳米颗粒的制备及用于类风湿性关节炎抗CCP抗体检测的研究

摘要

随着材料化学等科学的持续发展，新材料的开发和性能提高成为研究热点。近年研究发现，磁性Fe3O4纳米颗粒具有模拟过氧化物酶新功能，但其催化能力无法与天然酶辣根过氧化物酶(HRP)相媲美，科学家希望寻找新的途径提高模拟酶的催化能力，将鲁士蓝纳米薄膜或纳米颗粒是迄今发现的对于双氧水电子转移来说最有优势的低电位系统，因此本研究利用普鲁士蓝纳米颗粒构造模拟酶催化系统，大大提高了其与底物的亲和能力及催化能力，达到比HRP更优的水平，利用这一体系，提高生物检测的灵敏度。
　　类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病也是最多发的慢性炎症性关节疾病，晚期难以治疗，早期检测变得尤为重要，但目前仅有欧美少数几家公司能生产该疾病的早期诊断试剂盒，而且价格偏高，本研究利用普鲁士蓝纳米颗粒构造的模拟酶催化体系开发替代产品，旨在降低生产成本，简化制造工序，研究内容主要包括：
　　(1).在60℃水浴，柠檬酸保护的条件下，将K4Fe(CN)6溶液逐滴滴入不断搅拌的FeCl3溶液中，制备出稳定的普鲁士蓝纳米颗粒，并研究了各种反应参数对于颗粒形貌的影响。用UV-vis，FTIR，TEM，DLS等进行表征。UV-vis结果表明制备得到普鲁士蓝；使用FTIR进一步分析，表明羧酸根以螯合方式与普鲁士蓝颗粒表面Fe离子结合；通过TEM观察，发现粒子为正方体，平均边长37nm，有一定的结晶度；DLS测得粒子水动力尺寸为80nm，在水溶液中分散良好。米氏动力学常数的测定，证明其与底物的亲和能力大于HRP，并且具有比HRP更高的催化常数Kcat值，可替代其发挥催化作用。
　　(2).利用静电吸附将金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)与普鲁士蓝纳米颗粒(PBNPs)偶联，制备为能够进行多种疾病检测的通用型探针(Nano-probe)。然后利用DLS测量探针制备前后粒子水动力尺寸的变化，发现与SPA偶联后，水动力尺寸由80nm增加至155nm，加入BSA作为保护剂时，达到229nm。磷钨酸染色后，通过TEM观察到普鲁士蓝纳米颗粒与SPA紧密结合，形成探针。将得到的探针在SDS-PAGE凝胶中进行电泳实验，探索普鲁士蓝与SPA制备探针时的合适用量比例为1:0.3。接着通过ELISA实验优化探针制备时间，发现反应5分钟即显示出很好的ELISA检测效果，因此可以发展出一种使用前快速制备的通用型探针。最后研究了该探针的稳定性以及保存方法。
　　(3).为了将探针应用于早期类风湿性关节炎血清学检测，我们建立了兔子血清检测系统，通过矩阵实验优化探针稀释比例，通过酶标仪优化显色剂的配比。探针在其中显示了很高的灵敏度和特异性，并得到ELISA检测标准曲线。在应用于人类风湿性外关节炎检测中时，由于该疾病的血清国际上并无标准品，固将兔血清换成类风湿性关节炎检测金标准--欧蒙试剂盒中的阳性标准品进行研究，发现探针显示了较高的灵敏度，线性相关度为0.999，能够达到代替天然HRP检测类风湿性关节炎的诊断目的。