PHBV纳米纤维支架在骨组织工程中的应用研究

摘要

细胞生活的微环境在细胞的粘附生长以及相互作用中都扮演着重要的角色。为了模拟天然的细胞外基质结构，很多生物材料通过静电纺丝的方法被制备成了超细纤维。在众多的高分子聚合物中，PHBV这种细菌产生的聚酯以其生物降解性、无免疫原性和生物相容性在组织工程领域吸引了越来越多的关注。骨髓来源的间充质干细胞MSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，在不同的诱导条件下可以分化为许多不同类型的细胞，作为种子细胞广泛应用于组织工程中。
　　 在本研究中，通过改变溶剂、纺丝溶液的浓度及接收装置获得了五种不同直径和取向的PHBV纤维支架。通过形貌观察和力学测试，选取了三种连续性好，力学性质适宜的支架来研究纤维的直径和取向对MSCs生长行为的影响。结果表明，与其他支架相比，非定向的纳米纤维支架更有利于细胞的生长，而微米纤维的支架的细胞存活率最低。纳米纤维的取向性通过对细胞骨架的引导作用从而对细胞的形貌产生了显著的影响。定向和非定向的PHBV纳米纤维都是组织工程领域理想的备选支架。
　　 HA是天然骨的主要无机成分，有很好的骨传导性，无毒且不会引起炎症反应，在骨组织工程领域有广泛应用，但是其骨诱导能力并未得到有力证实。在本文中，通过静电纺丝的方法制备了负载HA颗粒的PHBV定向和非定向纳米纤维，用来研究纤维取向以及HA的加入对大鼠骨髓来源的MSCs体外增殖及分化的影响。细胞接种1、4、7天后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，结果表明不含HA的非定向PHBV纤维支架更适宜MSCs的粘附和增殖;接种1、2、4周后，检测成骨标志物:碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)以及钙结节;并在7、14天用real-time PCR检测成骨基因的表达。分化实验结果表明含有HA的非定向纳米纤维支架更有利于促进MSCs向成骨细胞的分化。
　　 静电纺丝纳米纤维可以很好的模拟细胞外基质，有利于细胞的粘附增殖，是一种很好的组织工程支架，但是目前其在骨组织工程中的应用主要是体外细胞层面研究或者是体内扁平骨修复，而没有长骨修复的先例，基于此，我们克服了平面纤维膜难以加工的特点，制备了基于PHBV/HA定向和非定向纳米纤维薄膜的三维支架，并植入兔桡骨缺损模型研究PHBV/HA三维支架以及支架的取向性对骨缺损修复的影响，每组8只动物。通过大体观察，X-ray摄片，组织学检测，力学测试以及SEM观察来评估骨缺损部位的修复效果。结果表明基于HA的PHBV定向和非定向三维支架均可以促进骨缺损的修复，但是材料降解缓慢，后期会阻碍骨修复。在此基础上我们通过调节PEO的含量改善了材料的降解性能，并用于动物实验取得了很好的骨修复效果。

目录

声明

摘要

简写对照表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 骨组织及骨缺损概述

1．2．1 骨的结构

1．2．2 骨缺损及治疗方法

1．2．3 骨修复的检测方法

1．3 骨组织工程材料

1．3．1 无机材料

1．3．2 高分子材料

1．3．3 复合材料

1．4 骨组织工程支架的制备方法

1．4．1 快速成型法

1．4．2 静电纺丝法

1．4．3 粒子致孔法

1．4．4 冷冻干燥法

1．5 MSCs在骨修复研究中的应用

1．5．1 MSCs的提取及鉴定

1．5．2 MSCs向成骨分化的体外研究

1．5．3 MSCs用于骨修复的体内研究

1．6 本论文研究的主要内容

参考文献

第二章 不同直径和取向的PHBV静电纺丝纤维对骨髓间充质干细胞生长行为的影响

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 材料

2．2．2 PHBV支架的制备

2．2．3 PHBV静电纺丝纤维的表征

2．2．4 MSCs的提取和培养

2．2．5 支架上MSCs的吖啶橙染色表征

2．2．6 支架上MSCs的细胞骨架染色

2．2．7 扫描电子显微镜对细胞形貌观察

2．2．8 细胞活性的检测

2．2．9 统计分析

2．3 结果分析

2．3．1 PHBV纤维支架的制备和表征

2．3．2 MSCs在四种PHBV支架上的增殖情况

2．3．3 MSCs在四种支架上的表面形貌

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

第三章 PHBV／HA复合纳米纤维对MSCs向成骨分化的影响

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 基于PHBV支架的制备和表征

3．2．2 MSCs提取和鉴定

3．2．3 实验分组

3．2．4 MSCs在PHBV／HA复合支架上的增殖测试

3．2．5 MSCs在PHBV／HA复合支架上的SEM表征

3．2．6 MSCs在PHBV／HA复合支架上ALP表达

3．2．7 MSCs在PHBV／HA复合支架上OCN的表达

3．2．8 MSCs在PHBV／HA复合支架上产生钙结节的检测

3．2．9 MSCs在PHBV／HA复合支架上成骨基因表达检测

3．2．10 统计分析

3．3 结果分析

3．3．1 纳米纤维支架的制备

3．3．2 MSCs的鉴定

3．3．3 MSCs在纤维支架上的增殖

3．3．4 MSCs在纤维支架上的分化

3．4 讨论

3．4．1 PHBV／HA纳米纤维的制备及对MSCs增殖的影响

3．4．2 PHBV／HA纳米纤维对MSCs向成骨分化的影响

3．5 结论

参考文献

第四章 PHBV／HA三维纤维支架对骨缺损修复的体内研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 基于PHBV／HA纳米纤维的三维支架的制备和表征

4．2．2 兔桡骨临界缺损模型的建立

4．2．3 术后检测方法和指标

4．2．4 材料降解性能改进及表征

4．2．5 改进材料的骨修复效果检测方法

4．2．6 统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 三维支架表征

4．3．2 骨修复检测

4．3．3 改进材料的降解及细胞相容性

4．3．4 改进材料骨缺损修复效果

4．4 讨论

4．4．1 PHBV／HA三维支架用于骨修复

4．4．2 PEO含量为40％的PHBV／HA支架用于骨修复

4．5 结论

参考文献

第五章 总结与展望

5．1 论文总结

5．2 论文创新点

5．3 论文的不足与展望

发表的论文及申请专利

致谢