AdEasy-CTLA4Ig与调节性T细胞延长大鼠移植肾存活时间的实验研究

摘要

器官移植是治疗各种终末期器官功能衰竭和肿瘤的最有效方法。但由于排斥反应的存在，使移植物的存活时间、移植后功能以及受体的生存时间、生活质量均不尽人意。免疫抑制剂的问世，特别是环孢素A(CsA)的问世，虽然使器官移植发生了里程碑式的进步，但由于免疫抑制剂存在一些根本的缺陷，如非特异性的全身免疫抑制，可使受体易遭受致命的感染；促发肿瘤；无法阻止慢性排斥反应的发生与进展；肝肾毒性以及其它并发症与副作用，仍然无法从根本上解决问题。 因此，任何从排斥反应的根本、也就是从机体免疫系统的范畴来解决移植免疫排斥问题是当今移植学界研究的热点。诱导受体的“免疫耐受”状态是治疗移植后排斥反应最令人憧憬的发展方向，也是唯一可能在不影响机体免疫状态情况下，使移植物与宿主共存的策略。所谓免疫耐受是指受体对供体的器官和组织产生耐受，不排斥，而对第三方的器官和组织有正常的免疫反应。 耐受与排斥是有机的统一体。免疫防御、免疫监视和免疫自稳是机体免疫系统永久存在的的三大原始功能。器官排斥是由T细胞所介导的。T细胞的活化需要双信号的激活，即MHC/Ag分子与TCR/CD3的结合所构成的第一信号系统，此信号是抗原特异性的。以及由抗原递呈细胞表面的配体与T细胞表面的共刺激信号结合而成的第二信号系统。第一信号系统与第二信号系统双重刺激将使T细胞活化，产生一系列的细胞因子，从而产生免疫应答反应。而如果仅有第一信号系统而缺乏第二信号系统的刺激，T细胞将无法活化，将产生免疫无能。第二信号系统包括CD28/B7，CD40/CD154等。CD28/B7是其中最重要的信号通路。 树突状细胞(DC)是人体内最强的抗原递呈细胞，一般分为两类，即髓样DC与淋巴样DC。DC的功能与DC的来源、发育的成熟程度、环境等因素关系密切。一方面，DC是体内功能最强的抗原递呈细胞，它可以引起强烈的免疫应答；另一方面，DC可以诱导免疫耐受，此种DC被称为耐受性DC(To1-DC)。耐受性DC指表型未成熟，能抑制T细胞反应的DC。目前研究认为，未成熟DC(immatureDC，iDC)是诱导免疫耐受，特别是外周性的免疫耐受原因。 由于耐受性DC的诱导免疫耐受作用，因此，制备耐受性DC是诱导移植耐受的重要方法之一。目前的方法有3种：一为分离耐受性DC，二为应用未成熟DC，三为调节DC至耐受状态。本研究旨在研究利用转基因(CTLA4-Ig)的方法考察能否使DC维持在未成熟状态，从而达到耐受的状态。本研究将通过运用CD28的同源分子CTLA4Ig的腺病毒载体以及树突状细胞(DC)的作用来阻断第二信号系统来考察其对于移植物生存的影响。 调节性T细胞(Treg)是维持机体免疫自稳的最主要机制。调节性T细胞对于外界的刺激能保持沉默，目前认为调节性T细胞在移植免疫中起负性调节作用，抑制免疫反应的产生与进展，是维持外周性耐受的主要机制之一。 在体外，对于TCR的刺激，CD4+CD25+调节性T细胞表现为“无能”与免疫调节的作用。在与初始性效应T细胞同时培养或激活之后，Treg可以抑制其分泌细胞因子与扩增作用。它们通过TCR介导激活，但激活后即表现为抗原非特异性。因此，推测其在体内，Treg细胞能否通过TCR传导的信号激活后，通过与效应性T细胞的直接接触，直接抑制CD4+与CD8+T细胞的活化、增殖，从而抑制排斥反应的发生与进展。这是本研究所要证实的猜想。 本实验分4部分： 1，肾移植模型的建立： 运用显微外科技术，分别利用Brown-Norway、F344和Lewis作供、受体，建立大鼠肾移植急性排斥反应模型和肾移植慢性肾移植排斥反应模型。在技术上，本研究运用供体肾静脉与受体左肾静脉相吻合，不阻断下肢血流；供体肾动脉与受体腹主动脉想吻合；供体输尿管膀胱瓣与受体膀胱相吻合的方法建立了新的肾移植模型。并采用供体双肾整体灌注，同时获取双侧肾脏作为供体器官，截取下腔静脉作为右肾静脉的一部分，首先建立了双侧供肾的移植模型。 2，pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建： 运用载体AdEasy构建了pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重组腺病毒载体。并运用PCR和westenblot验证构建成功。并作pAdEasy-1-CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的体外毒性实验：利用载体在不同的MOI下转染肾小管上皮细胞、ECV304细胞。并通过心肌细胞来观察其对心肌细胞的毒性与搏动的影响。 3，pADeasy-1-CTLA4Ig多途径诱导大鼠肾脏移植物存活时间延长的实验研究： 运用合成的pAdEasyCTLA4Ig基因重组腺病毒载体通过不同的方式来处理受体，以观察其对于移植免疫的作用。通过处理供体器官后直接受体注射、培养树突状细胞并转染pAdEasy-CTLA4Ig来处理受体等方法，考察转CTLA4Ig基因DC对于移植免疫的作用。并通过转基因DC的定植实验来探讨DC的作用机制。 4，Treg细胞诱导大鼠移植肾存活时间延长的实验研究： 通过免疫磁珠方法从外周分离CD4+CD25+调节性T细胞，经供体抗原诱导后单独或联合pAdEasy-CTLA4Ig基因重组腺病毒作用于受体，通过大鼠肾移植，考察其对于移植免疫的作用。 本研究所取得的主要结论如下： 1.成功建立了大鼠肾移植模型，包括急性肾移植排斥反应模型，慢性肾移植排斥反应模型，双侧供肾大鼠肾移植模型等。本实验通过近交系Brown-Norway(BN)和Lewis大鼠，运用显微外科技术建立了稳定的肾移植急性排斥模型。通过近交系F344和Lewis大鼠建立了肾移植慢性排斥反应模型。并通过对供体下腔静脉的裁剪，成功建立了双侧供肾大鼠的肾移植模型。此模型方法简单，手术成功率高，受体稳定，是一种节省、实用的器官移植方法。其中双侧供肾大鼠肾移植模型和肾移植慢性排斥反应模型的建立均是国内首先报道。 2.成功构建了AdEasy-1-CTLA4Ig载体。AdEasy是一种新颖的细菌内重组系统，其具有高效、方便、实用的特点。AdEasy系统能正确进行翻译后的修饰和折叠。另外，它携带有荧光基因，能十分方便的观察目的基因的转染效果和效率。本研究所合成的AdEasy-CTLA4Ig载体具有高效、低毒的特点。能在目的器官中高效转染和表达。能十分方便的观察载体的转染情况。其在体外无明显细胞毒性，用AdEasy-CTLA4Ig载体转染ECV-304细胞后24小时和48小时，细胞存活率与对照组无显著性差异；转染心肌细胞后2天、4天，心肌细胞的存活率和搏动率与对照组相比均无显著性差异。表明AdEasy-CTLA4Ig载体系统安全可靠。 3.DC的体内定植实验表明，在肾移植的早期，与对照组相比，转基因的DC定植于脾脏的数量略高，推测其与DC进入受体后，被摄取进入移植肾，然后归流到淋巴器官脾脏有关。 4.AdEasy-CTLA4Ig可以诱导受体对供体的免疫低反应，延长受体的生存时间。通过1×109pFUAdEasy-CTLA4Ig载体的注射加局部灌注供体器官可以诱导移植免疫低反应，延长移植器官的存活时间。与对照组相比，生存时间由8.83天延长到31.2天，两者有显著性差异。组织学检查显示实验组移植肾评分明显低于对照组，表明用AdEasy-CTLA4Ig可减轻排斥反应对移植肾的损害。 5.调节性T细胞作为免疫自稳的主要机制，其在移植免疫中起重要作用。实验证实，调节性T细胞(Treg)联合AdEasy-CTLA4Ig可以使移植物的生存时间延长至33.5天，与对照组有显著性差异。

目录

英文缩写一览表

摘要

前 言

第一部分大鼠肾移植模型的建立

第二部分AdEasy-1-CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

第三部分ADeasy-1-CTLA4Ig多途径诱导大鼠肾脏移植物存活时间延长的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分调节性T细胞延长肾移植大鼠生存时间的实验研究

照片

文献综述调节性T细胞

科技查新报告

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致 谢

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