碱性成纤维细胞生长因子和纤维粘连蛋白对成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响及其机制探讨

摘要

探讨了碱性成纤维细胞生长因子和纤维粘连蛋白对成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响及其机制，研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和纤维粘连蛋白(FN)在单一和联合应用时，对体外培养大鼠成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响，分析了骨组织工程中能够有效促进成骨细胞黏附的两种细胞外基质蛋白浓度的最佳组合方式，以及产生此种影响的潜在机制。 本文采用体外培养乳大鼠颅骨成骨细胞，并对其成骨表型进行碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色鉴定，并制备生物衍生骨对其理化性质进行测定。第三代成骨细胞分别用不同浓度的bFGF(0.1，1，10和100ng/ml)刺激；制备的生物衍生骨分别用不同浓度的FN(0.1，1，10和100μg/ml)和多聚赖氨酸(PLL)修饰。随后不同刺激的成骨细胞依次接种于不同修饰的生物衍生骨支架上，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各种组合间细胞在支架上的黏附差异，扫描电镜观察上架细胞的密度与形态。根据MTT法检测结果，选择最佳浓度组合，设置对照组，以1mmol/L GRGDS肽溶液封闭RGD-整合素α5β1黏附途径，再次重复上述MTT测定；Western-Blot检测bFGF是否对成骨细胞上的FN受体-整合素β1亚单位的表达产生影响。 研究结果表明：所培养细胞成骨表型鉴定显示碱性磷酸酶染色及钙结节茜素红染色阳性；制备的生物衍生骨材料，扫描电镜观察发现其保留了原骨组织的天然三维网状孔隙系统和骨盐结构，蛋白含量测定为0.01±0.007％，示蛋白含量极微。MTT法测定结果显示单独应用bFGF刺激细胞或FN修饰支架均可增强成骨细胞在生物衍生骨支架上的黏附效应(P<0.05)，二者联合应用时，产生的细胞黏附促进效应进一步增强，二者存在统计学上的交互作用(P<0.01)，其中以100ng/ml bFGF刺激细胞接种于10μg/ml FN修饰的生物衍生骨支架上产生的黏附促进作用最强。单独应用PLL修饰支架未能促进成骨细胞在生物衍生骨上的黏附(P>0.05)，PLL与bFGF亦不存在成骨细胞黏附促进的交互作用(P>0.05)电镜观察也证明， bFGF与FN联合应用时的细胞密度、铺展效果优于单独应用。以GRGDS肽封闭后，bFGF联合FN产生的黏附促进作用被显著阻断。Western blot检测发现应用bFGF刺激后，成骨细胞整合素β1亚单位表达增强。 结论：bFGF与FN对成骨细胞在生物衍生骨三维支架上的黏附存在协同促进作用，当100ng/ml bFGF刺激的细胞接种于10μ/ml FN修饰的生物衍生骨支架时可产生最大的黏附促进效应，而产生这种协同促进效应的机制很可能是由RGD-整合素α5β1黏附途径来介导的。

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