艾滋病毒Tat对HHV-8 K12基因诱导肿瘤形成的影响及其分子机制初探

摘要

本研究的目的:是探索人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1，又称艾滋病毒)反式激活转录蛋白(transactivative transcription protein，Tat)对人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)K12基因诱导肿瘤形成的影响及其分子机制。 实验首先构建了含HHV-8 K12基因的重组质粒K12-Flag-pcDNA3.1(+)(命名为pK12F)，将其与本室保存Tat-Flag-pcDNA3.1(+)(命名为pTatF)质粒单独或共转染NIH3T3细胞(Swiss小鼠成纤维细胞)，同时以空载体pcDNA3.1(+)为对照，获得稳定转染目的基因的四株细胞，分别命名为N/K12、N/Tat、N/K12/Tat、N/pcDNA3.1。进而采用<'3>HTdR掺入实验及流式细胞检测法分别测定上述四株细胞的增殖能力和细胞周期。<'3>HTdR掺入实验结果显示，四株细胞的增殖能力从高到低依次为N/K12/Tat、N/K12、N/pcDNA3.1、N/Tat(P<0.05)；流式细胞术结果显示，四株细胞的S期细胞比率(S-phase fraction，SPF)从高到低的排序与<'3>HTdR掺入实验结果一致。随后，软琼脂集落形成实验证实上述四株细胞均能体外诱导细胞转化。将四株细胞分别进行裸鼠体内成瘤实验的结果表明，自分泌和近距离旁分泌Tat蛋白能加速HHV-8 K12诱导肿瘤的形成(Log-rank检验，P<0.05)，远距离旁分泌Tat蛋白不具备此功能(P>0.05)。为进一步探索Tat和K12相互作用的机制，采用基因芯片技术对这四株细胞及其对应的肿瘤组织进行了与肿瘤形成相关15条信号通路96个标志物基因mRNA表达的检测，结果发现虽然细胞和组织结果存在差异，但均显示出Tat能促使K12基因激活更多的肿瘤信号基因。Western blot检测四株细胞中STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，信号转导和转录激活因子3)蛋白的磷酸化水平，结果显示Tat可以促进K12激活磷酸化STAT3的表达。免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中CyclinD1(周期蛋白D1)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管内皮细胞生长因子)和Survivin(存活素)的结果表明Tat能降低这些蛋白在K12诱导的肿瘤中的表达。 本研究结果提示，在体外Tat能增强K12转化细胞的增殖能力；裸鼠体内成瘤实验中自分泌和近距离旁分泌Tat蛋白均能加速HHV-8 K12诱导肿瘤的形成；STAT3信号通路是参与Tat加速K12诱导肿瘤生成的肿瘤信号通路之一；同时Tat降低了VEGF、Cyclin D1、Survivin在K12诱导肿瘤中的表达。

目录

声明

前言

第一部分 重组pK12F质粒的构建与N/K12、N/Tat、N/K12/Tat和N/pcDNA3.1稳定细胞株的建立

引言

材料和方法

结果

分析讨论

第二部分 艾滋病毒Tat和HHV-8K12在裸鼠成瘤过程中的相互作用

引言

材料和方法

结果

分析和讨论

第三部 分艾滋病毒Tat与HHV-8 K12相互作用机制的初步研究

引言

材料和方法

结果

3.1 基因芯片检测肿瘤标志性基因表达

3.2 WB检测转化细胞中STAT3和ERK1/2

分析与讨论

结语

参考文献

附录

致 谢

综述 人类疱疹病毒8型的肿瘤檅关基因