新型ATP敏感性钾通道开放剂埃他卡林对MPP所致帕金森病模型鼠的神经保护作用及其机制研究

摘要

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是常见的老年神经系统退行性病变，临床表现为运动徐缓、静止性震颤、肌僵直以及平衡功能失调等症状。PD的主要病理及生化改变为黑质-纹状体通路的多巴胺(dopamine，DA)能神经元退行性变、Lewy’s小体的出现以及纹状体DA含量的绝对减少。目前线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性、遗传因素以及炎症被认为是参与DA能神经元死亡主要病理机制，但是对于导致DA能神经元变性、死亡的机制目前仍不清楚。目前临床上PD的主要治疗措施是应用拟DA药左旋多巴(L-DOPA)替代疗法，尽管L-DOPA能缓解大多患者的症状，但不能阻止病程的进展，且长期使用易出现随意运动障碍、心血管功能异常等许多严重的不良反应，这已成为困扰PD临床治疗学的一大难题。因此，加强PD的病因学研究，发现研制治疗PD理想新药的有效靶标，对于提高人类健康水平具有重大意义。包括本实验室在内的研究工作表明，调节脑内神经胶质细胞的功能是神经保护的重要新策略。 ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannels，KATP)首先在心肌细胞上发现，随后发现其广泛分布在多种组织和细胞。KATP是一种耦联细胞电活动和代谢、以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。近年来，包括本实验室在内的研究表明：KATP特别是线粒体KATP(mitochondrialATP-sensitivepotassiumchannelchannel，mito-KATP)开放是重要的神经保护靶标，不仅是急性缺血缺氧、氧化应激等病理因素所致损伤时重要的内源性保护机制，而且在神经元受损中、后期的神经炎性病理反应以及神经元凋亡中也发挥重要的保护作用。新型KATP开放剂埃他卡林(iptakalim，IPT)是我国学者自行设计、合成的脂肪仲胺类小分子化合物，具有易透过血脑屏障、在不扩张血管和降低血压的剂量时即可产生确切的神经保护作用的特征，使得在整体水平上研究KATP开放剂的神经保护作用成为可能。研究发现，IPT在多种缺血/缺氧模型和神经退行性疾病模型中显现显著的神经保护作用。 星形胶质细胞是脑内数量最多的一类细胞，在维持细胞外液动态平衡、调节神经递质代谢、保护神经元及促进神经再生和修复过程中发挥重要的作用。大量研究表明星形胶质细胞的功能正常与否与PD等神经退行性疾病的发生发展密切相关。本文选用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyri-diniumion，MPP+)为致模毒素建立PD大鼠和细胞模型，旨在从整体和细胞水平研究IPT对星形胶质细胞功能的调节，从而进一步阐明其神经保护作用及相关机制，为将IPT发展为PD治疗新药积累必要的学术与实验基础。 第一部分埃他卡林对MPP+制备的帕金森模型鼠的神经保护作用 目的：研究IPT对MPP+制备的模型大鼠行为学、神经化学和病理学改变的影响及相关机制。 方法：SD大鼠分为五组：伪手术组；MPP+模型组；MPP++IPT(1.5mg·kg-1·day-1，p.o.)组；MPP++IPT(3.0mg·kg-1·day-1，p.o.)组；MPP++DZ(3.0mg·kg-1·day-1，p.o.)组。预先给予IPT(1.5mg·kg-1·day-1或3.0mg·kg-1·day-1)或mito-KATP开放剂DZ(1.5mg·kg-1·day-1)连续灌胃三天，第四天大鼠单侧纹状体立体定位注射MPP+90nmol，然后连续给予IPT或DZ7天。手术后第7天观察行为学变化，部分动物处死后立即分离脑组织，应用高效液相-电化学法(HPLC-ECD)检测纹状体DA及其代谢产物DOPAC的含量，部分动物灌注后取脑，免疫组织化学法检测黑质部酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，TH)、胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和ED1阳性细胞。 结果：单侧立体定位注射MPP+可以诱发大鼠产生运动协调功能障碍；与伪手术组相比，模型组大鼠损毁侧纹状体DA含量显著降低，仅为伪手术组的78﹪；损毁侧黑质部多巴胺能神经元显著缺失，为伪手术组的45﹪；同时，损毁侧黑质部星形胶质细胞和小胶质细胞显著增生、活化。预先给予IPT(1.5mg·kg-1·day-1，3.0mg·kg-1·day-1)或DZ(3.0mg·kg-1·day-1)能显著改善MPP+引起的大鼠运动协调功能障碍，减轻黑质部的多巴胺能神经元的缺失；同时，IPT和DZ能够抑制MPP+诱导的星形胶质细胞的增殖和小胶质细胞的活化，抑制外周血TNF-α的升高；IPT和DZ对损毁侧纹状体DA和DOPAC的含量无显著影响。 结论：IPT能够缓解MPP+导致的大鼠运动协调功能障碍、减少黑质部多巴胺能神经元的缺失，其保护机制与抑制MPP+活化神经胶质细胞、减少TNF-α的生成有关。 第二部分埃他卡林改善MPP+诱导的原代星形胶质细胞凋亡及功能障碍 目的：研究IPT对MPP+所致的星形胶质细胞凋亡、谷氨酸转运体功能降低和致炎因子释放的调节作用及其机制。 方法：MTT法测定星形胶质细胞活力；应用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)测定TNF-α的含量；[3H]-D,L-Glu法测定Glu再摄取；hoechst33342荧光染色测定细胞的凋亡；western-blotting法测定p38MAPK表达变化；JC-1荧光检测线粒体膜电位。实验分组：1)Control；2)MPP+；3)MPP++IPT；4)MPP++IPT+5-HD；5)MPP++DZ：6)MPP++DZ+5-HD。 结果：1)200μMMPP+诱导星形胶质细胞线粒体膜电位降低，导致细胞凋亡，10μMIPT和100μMDZ能够通过逆转MPP+引起的星形胶质细胞线粒体膜电位降低，抑制细胞凋亡。2)MPP+能显著抑制原代培养的星形胶质细胞摄取Glu，IPT和DZ能够逆转MPP+对星形胶质细胞Glu再摄取的抑制作用。3)MPP+能够诱导星形胶质细胞活化，释放炎症因子如TNF-α，上调p38MAPK磷酸化水平，IPT和DZ能够通过抑制MPP+诱导的p38MAPK磷酸化，减少TNF-α的生成。IPT的上述作用均可被选择性线粒体KATP阻滞剂5-HD拮抗。 结论：IPT能够抑制MPP+诱导的星形胶质细胞凋亡，抑制星形胶质细胞活化后释放TNF-α，逆转MPP+对星形胶质细胞Glu摄取功能的抑制作用。 本文研究工作表明新型KATP开放剂IPT能够显著缓解MPP+制备的PD模型鼠的症状、减少黑质多巴胺能神经元的缺失，其机制在于抑制MPP+诱导的星形胶质细胞凋亡、抑制MPP+诱导的星形胶质细胞的活化及其致炎因子的释放、改善星形胶质细胞谷氨酸转运体的功能。

目录

英文缩略词表

前 言

第一部分埃他卡林对MPP+制备的帕金森模型鼠的神经保护作用

第二部分埃他卡林改善MPP+诱导的星形胶质细胞凋亡和功能障碍

结语

参考文献

附 录在读期间发表或已完成的论文

综 述 PD动物模型的研究进展

致 谢

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