重组多肽Tat-HA-NR2B9C载体构建、表达与分离纯化

摘要

脑卒中是危害人类生命与健康的常见病、多发病，具有较高的致残率和死亡率。迄今，在临床上除早期使用溶栓药对脑缺血有效外，尚缺乏疗效明确的治疗药物。 通过对脑缺血模型的病理研究发现，NMDA(N-methyl-D-aspartate)受体过度激活导致脑损伤。兴奋性毒性假说认为，NMDA受体过度激活，引起大量的Ca<'2+>内流，是导致神经元损伤和死亡的主要原因。因此，大量的临床前理论研究认为NMDA受体拮抗剂可以治疗缺血性脑损伤。但是，近十年来NMDA受体拮抗剂的临床研究的结果表明，所有临床研究使用的NMDA受体拮抗剂均因疗效不确切或严重不良反应而被停用。有研究者认为，NMDA受体拮抗剂阻断NMDA受体兴奋性毒性作用的同时也阻断了NMDA受体的正常生理功能。因此，对于突触后信号通路的研究为阻断NMDA受体过度激活引起的兴奋性毒陛找到了新的途径。 PSD-95(postsynaptic density-95)是一种重要的调节蛋白，它将NMDA受体信号传递给细胞内蛋白和酶。PSD-95通过第二个PDZ结构域与NR2B羧基端的tSXV基序结合，同时也可以与nNOS(neuronal nitric oxide synthase)结合，激活nNOS。研究发现PSD-95介导了NMDA受体的过度激活所导致的NO(nitric oxide)释放，从而引起神经兴奋毒性。本实验室的研究还发现，NMDAR/PSD-95/nNOS偶联通路对神经元再生起抑制作用。因此阻断该通路的信号传导可能有利于减轻缺血性损伤，促进脑卒中后神经元的再生，从而改善脑缺血诱导的记忆功能损伤。Tat能够携带有功能的NRB9C多肽片断进入细胞内并有效的干拢NMDA受体和PSD-95的结合，阻断引起神经毒性的下游信号，但不影响神经突触的活性和生理状态TCa<'2+>的内流。动物实验表明，Tat-NR289C能够降低大鼠缺血后脑损伤的面积并能够促进神经功能的恢复。因此，Tat-MR2B9C多肽有可能成为一种用于治疗脑卒中的可行方法，同时为开发新的有临床应用价值的新药提供实验基础。 本论文研究的目的是原核表达Tat蛋白的蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)与NR289C的融合多肽片段，并在两片段中插入血凝素(hemagglutinin，HA)的附加抗原表位(epitope tag)。根据Tat、HA及NMDA受体羧基端9个氨基酸的氨基酸序列，在计算机辅助下设计出Tat-HA-NR289C多肽基因的全序列。根据该序列设计出4条寡核苷酸引物片断。以pED质粒为模版，同过三次加尾PCR将原pED质粒的L-ansB-C基因加尾合成Ans-Tat-HA-NR289C。将该基因克隆到pET-28a的限制性内切酶位点上，并预留酸水解位点(aspartyl-prolyl linker)，构建表达载体pED-Tat-HA-NR289C，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。经乳糖诱导后，融合蛋白表达量只有全菌体蛋白的5％左右，通过对培养基、诱导时间的优化，确定含0.1％精氨酸的LB培养基培养4小时后加入乳糖至终浓度5mM，诱导4小时后，融合蛋白表达量可以提高到全菌体蛋白的30％左右。该培养基命名为精氨酸富集培养基，用于提高Tat融合蛋白的表达量并且不影响菌体的生长。融合蛋白的大量表达形成包涵体，包涵体在4M尿素裂解下，释放融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C，并在2倍乙醇条件下被沉淀。在80mmol/L，HCl，50℃水解72h，融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C水解出目的多肽Tat-HA-NR289C。由于目的多肽等电点在10.4左右，经阳离子交换柱层析，在高盐离子浓度下洗脱目的蛋白。本论文成功构建了Tat-HA-NR289C与天冬酰胺酶C端的融合表达载体(pED-Tat-HA-NR289C)，并表达纯化了目的蛋白Tat-HA-NR289C。通过此过程建立了一套简单可行的融合蛋白表达、水解、分离与纯化的方法。通过该方法可以获得一定量的Tat-HA-NR289C多肽，用于研究其促进神经元再生(神经元增殖、分化、存活)，改善记忆功能障碍(Morris水迷宫空间学习记忆能力)等活性，同时进一步阐明NMDAR/PSD-95/nNOS偶联在脑缺血性损伤中所介导的兴奋性毒性，及该信号通路对神经元再生的抑制作用。并可以根据Tat-HA-NR289C的氨基酸片段构建一系列突变位点的多肽，为研究NR2B亚单位与PSD-95的PDZ-2结构域的相互作用和构效关系提供实验基础。

目录

论文说明：缩略语

声明

前言

第一部分质粒pED-Tat-HA-NR2B9C的构建

材料与方法

结果

分析与讨论

第二部分Tat-HA-NR2B9C的表达与分离纯化

材料和方法

结果

分析与讨论

小结

参考文献

(附录)发表文章：

致谢

综述