天然抗菌多肽elafin重组腺病毒载体构建及气道上皮细胞表达

摘要

目的构建天然抗菌多肽elafin基因高效表达载体——重组腺病毒载体,并探讨其在肺上皮细胞中的初步表达。方法提取人肺总RNA,进行elafin基因逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增,PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上;在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,获得腺病毒载体Ad-elafin;继之在293细胞内扩增,利用报告基因荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;重组腺病毒Ad-elafin转染原代培养的气道上皮细胞,24h后荧光显微镜观察GFP表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清液中elafin的含量。结果测序、酶切及PCR证实天然抗菌多肽elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功,同时转染气道上皮细胞24h后荧光显微镜可见GFP的表达,且转染组细胞上清液中elafin测定值为(2.4±0.4)ng/ml与对照组(1.9±0.3)ng/ml相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论elafin基因重组腺病毒载体成功构建,有利于elafin生物特性的研究。