日本血吸虫UV致弱尾蚴诱导不同品系小鼠的免疫保护作用及其相关机理的初步研究

摘要

日本血吸虫病仍然是严重危害我国人民身体健康的寄生虫病。2003年全国调查资料显示，我国共有现症患者80余万，受威胁人口达1亿。目前，血吸虫病的防治工作强调以化疗为主，结合钉螺控制、健康教育等手段来降低血吸虫病的危害。虽然，化疗起到了很好的治疗作用，但仍存在一些问题，如：化疗不能控制再感染，无法彻底阻断疾病的传播，长期使用吡喹酮可能导致抗药性的产生等。鉴于疫苗的研究和使用在世界范围内为人类预防和消灭许多传染性疾病起到了非常重要的作用，因此，研究血吸虫病疫苗，通过“短效”的化疗作用及疫苗接种后产生的“长效”免疫预防作用相结合来控制血吸虫病，成为上个世纪80年代以来全世界科学家的共识。 血吸虫病疫苗的研究历时70余年，大体上经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗研究阶段。迄今为止，在动物实验中，以辐照致弱尾蚴或童虫为免疫原的预防效果最佳。当然，应用辐照致弱尾蚴直接作为疫苗，存在着抗原材料有限、具有潜在感染的危险及可能引发有限病变的伦理问题等。但是，利用致弱尾蚴免疫模型揭示疫苗诱导保护力的机制，无疑将为最终获得行之有效的疫苗提供重要的理论基础。目前，关于辐照致弱尾蚴生物学的研究比较有限，包括其活力、外部形态、内部显微结构及抗原成分等，其诱导宿主产生免疫保护力的分子机制可能与致弱尾蚴进入宿主后的抗原递呈不同于正常尾蚴有关，包括辐照所致的尾蚴移行延迟、抗原成分改变(隐蔽抗原的暴露)及失去了正常尾蚴中下调免疫应答的特定蛋白等有关。因此，观察辐照致弱尾蚴的生物学改变，是研究其诱导相关的免疫保护机理的买验基础。值得注意的是，国内外对辐照致弱尾蚴的相关免疫学研究多集中在曼氏血吸虫，其在许多品系小鼠中可诱导60％～80％的保护力，γ射线致弱尾蚴免疫非人灵长类动物后可诱导产生大于50％的保护力。与曼氏血吸虫相比，对日本血吸虫辐照致弱尾蚴的研究起步较晚，多在借鉴曼氏血吸虫相关研究经验的基础上开展。而现有资料表明，日本血吸虫辐照致弱尾蚴在小动物(特别是小鼠)中诱导产生的保护力水平常不稳定，目前尚缺乏公认的能对其产生稳定高保护力的小鼠模型。本实验室曾在昆明鼠、DBA及C57BL/6小鼠品系进行小规模的UV(ultra-Violet，紫外线)致弱尾蚴保护力实验，希望构建日本血吸虫致弱尾蚴诱导保护力的小鼠模型，虽然抗体检测提示致弱尾蚴免疫诱导了高于正常尾蚴感染的特异性体液免疫应答，但是均未获得预期的保护力效果。本课题进一步深入地在多品系的小鼠进行了免疫保护实验，并观察比较了各实验组DBA小鼠的Th1/Th2细胞免疫应答特征，力图探讨小鼠的品系、免疫应答模式与对日本血吸虫感染的保护力之间的关系。 本文观察了UV致弱尾蚴和正常尾蚴活力，并利用扫描电镜、透射电镜及免疫电镜系统地观察日本血吸虫UV致弱尾蚴在外部形态、内部显微结构、抗原成分及其定位与正常尾蚴的异同。选取昆明鼠作为观察对象，观察了不同UV照射剂量、紫外光源等因素对免疫保护力的影响。在此基础上，又比较了不同鼠系(昆明鼠、DBA、BALB/c)经免疫后诱导的保护力。同时，对DBA小鼠的细胞免疫应答进行了动态观察。旨在继续探索可用于日本血吸虫UV致弱尾蚴免疫保护机制研究的小鼠模型，并探讨与日本血吸虫UV致弱尾蚴保护力有关的免疫应答机制。本研究结果进一步丰富了日本血吸虫UV致弱尾蚴保护性免疫机制的研究，为构建适宜的UV致弱尾蚴免疫保护力的动物模型提供了重要的基础资料。 1.尾蚴活力观察：经200、445(UV照射40秒)和800μ w/cm<'2>的UV照射1min，尾蚴的死亡率分别为：1.78％、1.73％和2.09％。经三种UV强度照射的尾蚴与未经照射的尾蚴的活力间无显著性差异(P>0.05)。 2.尾蚴体表及内部结构的电镜观察：UV致弱尾蚴与正常尾蚴相比，①其体部高度收缩，具有明显皱褶，尾部分叉明显肿胀，体部向内凹陷，且体棘缺损，边缘粗糙；②肌纤维层变薄，有少许断裂，线粒体未见明显的嵴状结构；③UV致弱尾蚴切片上的胶体金颗粒少于正常尾蚴切片，特别是肌纤维处，且UV致弱尾蚴切片上的胶体金颗粒在多部位有聚集分布现象。由此可能提示，UV照射损伤了尾蚴的体表、肌肉、重要代谢器官的结构，尾蚴抗原成分也能发生了变化。 3.昆明鼠、DBA及。BALB/c小鼠为对日本血吸虫UV致弱尾蚴低应答的小鼠品系。昆明鼠经不同UV强度、不同紫外源照射的日本血吸虫尾蚴免疫后的保护力为-1.0～23.75％；昆明鼠、DBA、BALB/c小鼠经100条/鼠的免疫剂量、免疫与攻击间隔4周，致弱尾蚴所诱导的保护力均较低(8.13％～26.9％)。与本实验室前期保护力实验的结果一致，提示昆明鼠、DBA、BALB/c小鼠不适宜作为日本血吸虫UV致弱尾蚴免疫保护力研究的动物模型。 4.观察DBA鼠在日本血吸虫UV致弱尾蚴免疫组、正常尾蚴感染组及先免疫后攻击组之间血清中IL-4、IL-10、IFN-γ及IL-12p40的水平变化。结果显示，致弱尾蚴免疫组小鼠血清中IL-12p40在免疫后第3周降到最低水平，但是总体上细胞因子在0～4周并未产生明显变化；与感染组和先免疫后攻击组相比，细胞因子总体水平较低，尽管IL-10及IFN-γ在3组之间的各个时间点并无显著差异(P>0.05)，且免疫组IL-12p40的水平在第1周和第2周时又分别高于感染组和先免疫后攻击组(P<0.05)；对比感染组与先免疫后攻击组细胞因子水平可以看出，两组之间4种细胞因子的水平并无显著差异。可见，宿主在UV致弱尾蚴免疫后未能产生有效的细胞免疫应答，这可能是日本血吸虫致弱尾蚴免疫在该品系小鼠不能产生免疫保护作用的主要原因。

目录

声明

前言

第一部分紫外线致弱尾蚴生物学特性的研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分日本血吸虫UV致弱尾蚴在不同条件下诱导不同品系小鼠的免疫保护作用的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述