基于纳米聚合物的转染方法的建立及其在基因敲除方面的初步研究

摘要

壳聚糖和聚乙烯亚胺(PEI)是两种受到广泛研究的阳离子聚合物基因载体，能有效浓缩核酸物质、保护其不被降解、将核酸物质转入细胞并表达。而转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)是一种新的分子生物学编辑工具，能任意靶向基因组任意位点，实现基因敲除等功能。特别设计构建的靶向敲除某个基因的TALEN质粒能在细胞内特异性敲除基因组中该基因。本文利用壳聚糖和PEI作为基因载体，将设计并构建的能敲除CCR5基因的TALEN质粒对转入细胞，实现细胞基因组中CCR5基因的靶向敲除，从而为减少CCR5受体的表达，阻止艾滋病病毒HIV-1进入细胞，最终治疗艾滋病奠定坚实的基础。本课题分为三部分工作:
　　第一部分是建立以壳聚糖(Chitosan)为载体的细胞转染方法。首先通过直接法和间接法制备Chitosan/pDNA复合物，并以此转染HEK293T、Hela细胞。结果显示，直接法制备的Chitosan/pDNA复合物并没有成功转入HEK293T、Hela细胞，间接法虽然成功制备了大小均匀的壳聚糖球形纳米颗粒，但制备复合物后也没有成功转入HEK293T、Hela细胞，因此将壳聚糖作为非病毒载体来传递基因需要对其本身物理化学性质、纳米颗粒的尺寸、转染机制等进行进一步的深入研究。
　　第二部分是建立以PEI为载体的细胞转染方法。这部分初步建立了以PEI为载体的转染方法，并通过条件优化如N/P比的优化、转染介质的优化等对该方法进行改善，来提高其传递基因进入细胞的效率。在转染过程中使用减血清培养基，且PEI/pDNA复合物的N/P比例在3～6范围内时，细胞的转染效率最高，且没有产生明显的细胞毒性。
　　第三部分是基于PEI作为基因载体方法的基本建立，将该方法应用于艾滋病的基因治疗的前期基础研究，即使用PEI载体将TALEN质粒转入HEK293T、Hela细胞进行CCR5基因的靶向敲除。本研究首先设计并成功构建了靶向CCR5基因的TALEN质粒对，然后以PEI为载体，将其转入HEK293T、Hela细胞来验证其靶向敲除CCR5基因的效果，从而为进一步将PEI载体和TALEN用于艾滋病的基因治疗提供一种新的选择，为广大艾滋病患者提供新的希望。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 艾滋病的免疫治疗

1．1．2 艾滋病的高效抗逆转录病毒治疗

1．1．3 艾滋病的基因治疗

1．2 基因载体系统

1．2．1 基于磷酸钙的载体系统

1．2．2 基于脂质体的载体系统

1．2．3 基于阳离子聚合物的载体系统

1．3 基因组编辑工具

1．3．1 锌指核糖核酸酶(ZFN)

1．3．2 转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)

1．4 本论文内容与提纲

参考文献

第二章 壳聚糖用作质粒pEGFP-N1的载体用于转染Hela、HEK293T细胞

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 Chitosan／pDNA纳米复合物的制备

2．2．3 细胞转染实验

2．2．4 细胞毒性测试

2．3 结果与讨论

2．3．1 直接法制备的复合物转染细胞结果

2．3．2 间接法壳聚糖纳米颗粒的表征

2．3．3 间接法制备的复合物转染细胞结果

2．3．4 细胞毒性测试结果

2．4 小结

参考文献

第三章 聚乙烯亚胺用作质粒pEGFP-N1的载体用于转染Hela、HEK293T细胞

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与仪器

3．2．2 Hela、HEK293T细胞培养

3．2．3 pEGFP-N1质粒的获取

3．2．4 细胞转染实验及条件优化

3．2．5 毒性测试

3．3 结果与讨论

3．3．1 细胞转染结果

3．3．2 细胞转染条件的优化

3．3．3 细胞毒性测试

3．4 小结

参考文献

第四章 聚乙烯亚胺载体用于传递功能性TALEN质粒来实现体外细胞基因敲除

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂、耗材与仪器

4．2．2 靶向敲除CCR5基因的TALEN质粒的构建

4．2．3 PEI传递TALEN表达质粒对进入细胞的效率

4．2．4 靶向敲除CCR5基因的TALEN质粒的活性检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 构建的TALEN质粒的序列鉴定

4．3．2 PEI传递TALEN表达质粒对进入细胞的效率

4．3．3 TALEN质粒的活性检测

4．4 小结

参考文献

第五章 总结与展望

硕士期间发表的论文和专利

致谢