稳定干扰端粒酶催化亚基及转录因子对SGC-7901细胞增殖和端粒酶活性的影响

摘要

利用RNAi技术高效、特异地阻断癌基因表达是治愈肿瘤的希望。研究表明，85％以上的恶性肿瘤组织表达端粒酶活性，而正常组织细胞缺乏端粒酶活性。端粒酶催化亚基hTERT是端粒酶的核心组分，也是端粒酶活性的限速因子，在80％-90％的肿瘤细胞中表达，在细胞永生化和肿瘤形成中起主要作用，因此成为理想的抑瘤靶点。hTERT基因表达调控主要分为两个关键阶段：转录激活因子对hTERT启动子的激活--启动转录；转录后水平的调控。由于端粒酶活性抑制与细胞增殖抑制之间存在“滞后现象”，长效的端粒酶活性抑制是获得较好的抗癌效果的保证。本研究利用载体表达的shRNA可以在细胞内稳定表达，具有长效干扰作用的特性，拟在hTERT基因表达调控的两个关键环节对hTERT基因表达进行干预，探讨其抗肿瘤效应。 1、构建靶向hTERT、TRAP基因的shRNA表达载体psi-hTERT、psl-TRAP 化学合成编码靶向端粒酶hTERT及其转录激活因子基因TRAPmRNA序列的短发夹寡核苷酸序列(各63个碱基)，经退火后克隆到线性化的psilencer<'TM>2.1-U6 neo表达载体。重组构建的psi-hTERT、psi-TRAP载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明63个碱基对成功插入到预计位点，并且序列完全一致。说明成功构建了psi-hTERT、psi-TRAP shRNA表达质粒。 2、psi-hTERT对SGC-7901细胞端粒酶活性和细胞增殖的长效影响 将构建的psi-hTERTl和psi-hTERT2用脂质体转染SGC-7901细胞，然后用G418筛选，获得稳定表达克隆后，半量G418N力培养3个月，real-time PCR检测hTERT基因mRNA表达，western blot检测hTERT蛋白水平、TRAP-ELISA方法检测细胞端粒酶活性，MTT法检测细胞增殖活性。实验结果显示，稳定转染psi-hTERT的实验组与对照组比较，hTERT mRNA表达水平psi-hTERTl组下降75.1％，psi-hTERT2组下降85.9％，hTERT蛋白psi-hTERTl组下降68.6％，psi-hTERT2组下降80.4％，端粒酶活性水平psi-hTERTl组下降36.36％，psi-hTERT2组下降51.19％，均具有显著性差异。与对照组比较，两实验组细胞增殖明显减慢，细胞凋亡率增加。结果提示，设计的针对hTERT基因的两对靶序列是有效的，载体表达的shRNA 在SGC-7901细胞内具有长效的端粒酶活性抑制作用和抗肿瘤效应，hTERT是肿瘤基因治疗的有效靶点。 3、psi-TRAP对SGC-7901细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响 将构建的psi-TRAPl和用psi-TRAP2)脂质体转染SGC-7901细胞，然后用G418筛选，获得稳定表达克隆后，半量G418N力培养3个月，real-time PCR方法检TRRAP基因、hTERT基因的mRNA水平实验结果显示，psi-TRAPl组抑制效率达85.0％；psi-TRAP2组抑制效率为54.6％。hTERT基因的mRNA水平也降，psi-TRAP1组为0.136± 0.02、psi-TRAP2组为0.315±0.03，明显低于psi-control组0.382±0.03。 Western blot检测hTERT蛋白水平，psi-TRAPl组0.463±0.01， psi-TRAP2组1.35±0.04，psi-control组为1.980±0.01。TRAP-ELISA检测细胞端粒酶活性，psi-TRAPl组抑制率达36.3％，psi-TRAP2组抑制率为7.1％。实验组与对照组之间均有统计学差异(P<0.05)。与对照组比较，实验组细胞增殖减慢，细胞凋亡率增加。结果提示：设计针对TRAP基因的两对靶序列也是有效的，可以显著性降低TRAP基因的表达，从而下调hTERT基因启动子活性，降低hTERT基因的转录水平，使hTERT mRNA和蛋白水平降低，细胞端粒酶的活性下降，具有抗肿瘤效应，是肿瘤基因治疗的又一途径。 4、联合干扰hTERT不同靶序列及其转录激活因子基因TRAP对SGC-7901细胞的影响 为了寻找更为有效的端粒酶抑制途径，探讨同时干扰hTERT基因及其转录激活因子基因TRAP是否具有协同下调端粒酶活性的作用，我们将psi-hTERTl分别与psi-hTERT2和psi-TRAPl联合共转染SGC-7901细胞，检测其对hTERT基因表达、端粒酶活性、SGC-7901细胞增殖的影响。实验结果表明，两联合干扰组与对照组比较，hTERT基因的表达在mRNA、蛋白水平明显下调，细胞增殖减慢，细胞凋亡率增加。但psi-hTERTl联合psi-TRAPl组与对照组比较无显著性差别。 5、稳定干扰hTERT联合化疗药物对SGC-7901细胞增殖活性的影响 选择两种常用的化疗药物DDP、5-FU分别联合psi-hTERT1和 psi-hTERT2，探讨psi-hTERT表达载体对化疗药物的增敏作用，MTT检测结果表明psi-hTERT可以提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。 综上所述，hTERT是肿瘤治疗的理想靶点；psi-hTERT和psi-TRAP具有长效抗增殖活性和化疗增敏作用，针对hTERT及其转录激活基因TRAP的RNA干扰策略是一种有效的肿瘤生物治疗方法。多基因联合或联合化疗可能是肿瘤治疗发展的趋势。

目录

声明

前言

第一部分干扰端粒酶催化亚基hTERT对SGC-7901细胞增殖和端粒酶活性的长效影响

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分干扰端粒酶调节相关基因TRAP对hTERT基因表达及SGC-7901细胞增殖的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分联合干扰hTERT不同靶序列及其转录激活因子TRAP基因对SGC-7901细胞的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分稳定干扰hTERT联合化疗药物对SGC-7901细胞增殖活性的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

附录

致谢

文献综述