骨髓干细胞移植联合促红细胞生成素治疗缺血性心血管病的研究

摘要

全文分为五部分： 第一部分 骨髓间充质干细胞的培养和鉴定 目的:优化获取大鼠骨髓间充质干细胞(mesenclaymal stem cells，MSC)并对其进行纯化、鉴定，同时对其生物学特性进行研究，为细胞移植治疗缺血性心血管病奠定基础。 方法:采用贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓问充质干细胞，传代扩增，观察细胞形态。选用第2代骨髓间充质干细胞采用MTT法鉴定MSC的增殖和自我更新能力；选用第4代MSC，利用成脂培养基定向诱导MSC分化为脂肪细胞，利用油红0免疫组化染色鉴定分化后的细胞；采用流式细胞仪观察细胞表面标志物的表达。 结果:分离和纯化的大鼠MSC呈均匀有序的成纤维细胞样形态，出现增殖性生长，能够被诱导分化为脂肪细胞。经流式细胞仪检测显示CD44，CD90阳性，CD45，CD34阴性。 结论:采用贴壁细胞分离法可以得到纯化的骨髓MSC，MSC具有高度增殖、自我更新和定向分化为脂肪细胞的能力，而且此方法简便易行。 第二部分 促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响 目的:观察促红细胞生成素(Eryrthropoietin，EPO)对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)增殖和细胞周期的影响。 方法:无血清条件下，不同剂量(0,0.25，0.5，1，2，10U/ml)EPO与MSC共培养24小时，MTT方法检测MSC增殖情况；10U/ml EPO与MSC共培养72小时后，流式细胞仪检测细胞周期情况。 结果:MTT结果表明，EPO呈剂量依赖性促进MSC增殖，除0.25U/ml剂量外，其余各组都与对照组有显著性差异，以10U/ml EP0促MsC增殖作用最明显。流式细胞检测表明，EPO组能降低G0/G1期比例，增加S期和G2/M期细胞比例，与对照组相比，差异均有显著性意义(P<0.05)。 结论:EPO可以促进骨髓间充质干细胞增殖，并且这种影响呈剂量依赖性。 第三部分 促红细胞生成素抑制骨髓间充质干细胞凋亡、促进旁分泌作用的研究 目的:观察促红细胞生成素(Eryrthropoietin，EPO)对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)凋亡和旁分泌血管内皮生长因子(vascularendothelial growthfactor，VEGF)的影响。 方法:无血清条件下，不同剂量(0,0.25，0.5，1，2，10U/ml)EPO与MSC共培养24小时，ELISA方法检测MSC分泌VEGF情况；2U/ml EPO、2U/ml EPO加50nM wortmannin或单纯培养液在无血清情况下与MSC共培养24小时后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果:EPO能显著减少无血清条件下的细胞凋亡，wortmannin部分抑制了EPO抗细胞凋亡能力(P<0.05)。EPO培养条件下，MSC分泌的VEGF明显增加。VEGF浓度和EPO剂量之间存在剂量依赖性关系。 结论:EPO可以抑制骨髓间充质干细胞凋亡，增加其旁分泌作用。 第四部分 骨髓间充质干细胞移植联合促红细胞生成素应用对大鼠心肌梗死的影响 目的:促红细胞生成素通过PI3K/AKt途径诱导血管生成和抑制细胞凋亡。骨髓间充质干细胞移植可以改善心肌缺血后心脏灌注和提高心功能。本研究探讨EPO能否增加MSC移植效果。 方法:32只Wistar大鼠随机分为心肌梗死组(MI)、EPO组(EPO)、骨髓间充质干细胞移植组(MSC)和联合治疗组(MSC-EPO)，永久结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。通过局部注射的方法将培养的大鼠自体骨髓MSC移植入梗死区，EPO组及联合治疗组围手术期每天腹腔注射EPO(3000 IU/kg)，共3d，14 d后再连续注射3 d，术后2 d及21 d二维超声心动图检测心功能。术后2l d Western blot和免疫组化检测评价治疗效果。 结果:术后21 d MI组心功能较术后2 d明显恶化，而其余3组明显改善，其中尤以联合治疗组改善最为明显。术后21 d，MSC-EP0组与其他3组相比较，心肌梗死面积明显减小；免疫组化显示毛细血管密度显著增加、Bcl-2明显上调而Bax明显下调；Western blot显示：磷酸化AKt与总AKt比值明显上升。MSC组以及EPO组与MI组之间比较有统计学差异。MSC在体内能分化为内皮细胞、平滑肌细胞和心肌样细胞。 结论:MSC移植和EPO注射都可以改善心肌梗死后心功能。EPO增强了MSC移植在大鼠心肌梗死后促血管形成及改善心功能作用；EPO的这种治疗作用部分通过其自身的促血管形成作用、抗心肌细胞凋亡、促进干细胞增殖作用来介导的。 第五部分 促红细胞生成素增强骨髓间充质干细胞治疗下肢缺血作用 目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)和促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)都有促血管生成和保护缺血器官的作用。本研究观察联合MSC和EPO是否有协同改善小鼠下肢缺血功能的作用。 方法:结扎股动脉造成下肢缺血模型，随机分为4组：MSC组、EPO组、MSC-EPO组和对照组。MSC组和MSC-EPO组在下肢缺血后一天移植3×10<'6>绿色荧光小鼠源骨髓MSC，EPO组和MSC-EPO组在下肢缺血后一天皮下连续注射7天EPO(5000u/Kg/d)。治疗后1，3，7天ELISA法检测缺血下肢VEGF水平。缺血后21天，激光多普勒检测下肢血流恢复情况，病理标本检查组织学和毛细血管密度，激光共聚焦检测移植MSC分化情况。 结果:与对照组相比，单独MSC或EPO治疗都明显增加缺血下肢VEGF表达(P<0.05)，联合MSC和EPO能进一步促进VEGF表达(P<0.05)。治疗后21天，与对照组比较，MSC或EPO组缺血下肢血流明显改善(P<0.05)，毛细血管密度也显著增加(P<0.05)；而联合治疗组缺血下肢血流和毛细血管密度明显高于单独治疗组(P<0.05)。激光共聚焦检测显示移植的MSC能分化为内皮细胞和平滑肌细胞。 结论:联合MSC和EPO较单独MSC移植能进一步改善缺血下肢功能恢复和组织重塑，这可能与EPO 抑制 MSC凋亡，促进MSC分泌VEGF以及EPO本身生血管能力有关。

目录

声明

第一部分骨髓间充质干细胞的培养和鉴定

第二部分促红细胞生成素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响

第三部分促红细胞生成素抑制骨髓间充质干细胞凋亡、促进旁分泌作用的研究

第四部分骨髓间充质干细胞联合促红细胞生成素对大鼠心肌梗死的影响

彩图1

彩图2

第五部分促红细胞生成素增强骨髓间充质干细胞治疗下肢缺血作用

综述

致谢