B细胞交叉递呈DRibbles抗原诱导免疫应答及抗肿瘤作用的研究

摘要

自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解胞浆中受损或废弃的细胞器和大分子物质的过程。自噬对细胞的代谢、能量循环、细胞器更新以及维持细胞内稳态有至关重要的作用。研究表明，细胞自噬与人类疾病，尤其是肿瘤的发生和发展有重要的相关性。
　　本课题组的前期研究发现，抑制蛋白酶体降解途径，同时用雷帕霉素诱导自噬途径，可以摹集大量自噬小体(将其命名为DRibble:DRips in Blebs，即DRs)，它能作为抗原交叉递呈的物质基础[1]。
　　B细胞除介导体液免疫外也是重要的抗原递呈细胞(APC)。然而，静息的B细胞不仅不能激活初始T细胞(Na(i)ve T cells)，反而会使它失活[2,3]。即使采用LPS等刺激来活化B细胞并上调其MHCⅠ类、Ⅱ类分子以及CD80/86等共刺激分子依旧无法有效活化初始T细胞，尤其是B细胞很难交叉递呈抗原激活初始CD8+T细胞[4]。多年来，人们尝试了很多方法激活B细胞来提高其激活初始CD4+T和CD8+T细胞的抗原递呈能力。通过CD40分子活化B细胞一直是人们研究的重点。研究显示:刺激B细胞的CD40分子，在体外能够活化外周血来源的B细胞、上调其表面MHCⅠ类和Ⅱ类分子以及CD80/86等共刺激分子，并使B细胞大量增殖[5]。CD40活化的B细胞负载各种抗原后，在体外能诱导抗原特异性的初始CD4+T细胞和CD8+T细胞应答[6]。体内研究也表明，活化B细胞可以诱导T细胞应答。此外，Jiang等发现初始B细胞在CpG的预先作用下，能够发挥交叉递呈功能激活CD8+T细胞[7]。DRibbles不仅充分利用了肿瘤细胞全部的抗原信息，包括长寿蛋白和短寿蛋白等，而且含有多种DAMP分子。我们的前期实验证实:DRs能以TLR2-MYD88依赖方式活化B细胞，而且活化的B细胞能直接交叉递呈DRs抗原诱导效应T细胞再次应答[8]。然而，基于B细胞的DRibble疫苗诱导T细胞应答及其抗肿瘤效果还有待进一步研究。
　　目的:
　　1、研究B/DRibbles加强免疫能否增强DRibbles疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用。
　　2、研究联合CpG和抗CD40抗体预处理的B/DRibbles疫苗能否进一步增强B/DRibbles疫苗诱导的免疫应答和抗肿瘤作用。
　　方法:
　　1.在OT-1细胞过继小鼠模型上，观察B/DRibbles(OVA+)加强免疫能否增强DRibbles(OVA+)疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用:
　　1.1建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型，用DRibbles(OVA+)初始免疫，同时过继OT-1细胞，随后以B/DRibbles(OVA+)疫苗进行两次加强免疫，观察肿瘤生长情况和小鼠生存期限;
　　1.2首次治疗后第10天处死部分小鼠，收集脾脏和淋巴结细胞，流式检测OT-1细胞的比率;
　　1.3 DRibbles体外刺激淋巴细胞72小时后ELISA法检测上清中IFN-γ水平。
　　2.在野生型小鼠肿瘤模型上，观察B/DRibbles加强免疫能否增强DRibbles疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用:
　　2.1建立C57BL/6小鼠EG7肿瘤模型，用DRibbles初始免疫，但不过继OT-1细胞，随后以B/DRibbles疫苗两次加强免疫，观察肿瘤生长情况和小鼠生存期限;
　　2.2首次治疗后第10天处死部分小鼠，观察脾脏形态并收集脾脏和淋巴结细胞;DRibbles体外再刺激72小时后，ELISA法检测上清中IFN-γ水平;
　　2.3首次治疗后第15天采集小鼠内眦静脉血，检测血清中抗EG7抗体水平;
　　2.4首次免疫后第40天取小鼠肿瘤组织，检测其中浸润CD4+T和CD8+T细胞比例。
　　3.观察联合CpG和抗CD40抗体能否优化B/DRibbles疫苗诱导的抗肿瘤作用
　　3.1建立C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型，用DRibbles初始免疫，随后以B/DRibbles疫苗或联合CpG和抗CD40抗体优化的B/DRibbles疫苗进行两次加强免疫，观察肿瘤生长情况和小鼠生存期限;
　　3.2首次治疗后第10天处死部分小鼠，收集脾脏和淋巴结细胞，体外培养并加抗原再刺激，72小时后收集培养上清，ELISA法检测上清中IFN-γ水平。
　　结果:
　　1.在OT-1细胞过继小鼠模型上，观察B/DRibbles(OVA+)加强免疫能否增强DRibbles(OVA+)疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用:
　　1.1与PBS组相比，DRs(OVA+)单独免疫组小鼠肿瘤生长明显减慢，平均生存时间明显延长(28天vs53天);两次输注未负载DRs(OVA+)的B细胞并未减慢肿瘤生长及延长平均生存时间(53天vs56天);与未负载DRs(OVA+)的B细胞组相比，两次输注负载DRs(OVA+)的B细胞能明显减慢肿瘤生长，显著延长平均生存时间(56天vs＞84天)，并100％小鼠(5/5)的肿瘤完全消失。提示:B/DRs(OVA+)加强免疫能增强DRs(OVA+)疫苗的抗肿瘤效果;
　　1.2检测各组免疫应答发现:与PBS组相比，DR(OVA+)单独免疫组小鼠OT-1细胞略有增殖（OT-1细胞比率:2.5％vs3.5％）;两次输注未负载DRs(OVA+)的B细胞并没有促进OT-1细胞的增殖（OT-1细胞比率:3.5％vs3.2％）;与未负载DRs(OVA+)的B细胞组相比，两次输注负载DRs(OVA+)的B细胞能明显增加OT-1细胞的增殖（OT-1细胞比率:3％vs5.3％）;
　　1.3检测细胞培养上清中IFN-γ发现;与PBS对照组相比，DRs(OVA+)单独免疫组产生的IFN-γ有一定程度的升高(80pg/ml vs800pg/ml);但两次输注未负载DRs(OVA+)的B细胞并没有增加IFN-γ的分泌量(800pg/ml vs830pg/ml);与未负载DRs(OVA+)的B细胞组相比，两次输注负载DRs(OVA+)的B细胞能够明显增加IFN-γ的分泌量（800pg/ml vs3100pg/ml）;
　　2.在野生型小鼠肿瘤模型上，观察B/DRibbles加强免疫能否增强DRibbles疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用:
　　2.1与PBS对照组相比，DRs单独免疫组小鼠的肿瘤生长减慢，平均生存时间延长(21天vs27天);两次输注未负载DRs的B细胞并未减慢肿瘤生长及延长平均生存时间(27天vs28天);与未负载DRs的B细胞组相比，两次输注负载DRs的B细胞能够明显减慢肿瘤生长，显著延长平均生存时间(28天vs42天)，但和两次输注负载DRs的DC组没有明显差异(42天vs49天)。提示:B/DRs加强免疫能增强DRs疫苗的抗肿瘤效果;
　　2.2检测各组免疫应答发现:与PBS组比，DRs单独免疫组小鼠脾脏稍增大(脾细胞计数:7×106vs12×106);两次输注未负载DRs的B细胞并未促进脾脏肿大(脾细胞计数:12×106vs14×106);与未负载DRs的B细胞组相比，两次输注负载DRs的B细胞能明显使脾脏肿大(脾细胞计数:14×106vs25×106)，但和两次输注负载DRs的DC组比无显著差异(脾细胞计数:25×106vs26×106);淋巴细胞体外用DRs再刺激后，与PBS组比，DRs单独免疫组产生的IFN-γ水平有小幅升高（20pg/ml vs100pg/ml）;但两次输注未负载DRs的B细胞并没有增加IFN-γ的分泌量(100pg/ml vs90pg/ml);与未负载DRs的B细胞组相比，两次输注负载DRs的B细胞能够明显增加IFN-γ的分泌量(90pg/ml vs360pg/ml)，但与和两次输注负载DRs的DC组没有明显区别(360pg/ml vs380pg/ml);
　　2.3检测血清中抗EG7特异性抗体发现:与PBS组相比，DRs单独免疫组抗体有一定程度的升高;两次输注未负载DRs的B细胞并没有增加抗体水平;与未负载DRs的B细胞组相比，两次输注负载DRs的B细胞能够明显增加抗体水平，但和两次输注负载DRs的DC组相比无显著差异;
　　2.4检测各组肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例发现:与PBS对照组相比，DRs单独免疫组小鼠肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例有一定程度的增加（CD4+T细胞比例:0.5％ vs2.5％; CD8+T细胞比例:0.8％vs2.5％）;但两次输注未负载DRs的B细胞并没有增加CD4+T细胞和CD8+T细胞比例（CD4+T细胞比例:2.5％ vs2.6％; CD8+T细胞比例:2.5％vs3.0％）;与未负载DRs的B细胞组相比，两次输注负载DRs的B细胞能够明显增加CD4+T细胞和CD8+T细胞比例(CD4+T细胞比例:2.6％ vs8.0％; CD8+T细胞比例:3.0％vs10.0％)，但和两次输注负载DRs的DC组相比无显著差异(CD4+T细胞比例:8.0％ vs11.0％; CD8+T细胞比例:10.0％vs11.0％)。
　　3.观察联合CpG和抗CD40抗体能否优化B/DRibbles疫苗诱导的抗肿瘤作用:
　　3.1与两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的B细胞组相比，两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的、负载DRs的B细胞组小鼠的肿瘤生长减慢，平均生存时间延长(32天vs＞60天）;与两次输注负载DRs的B细胞组相比，两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的、负载DRs的B细胞能进一步减慢肿瘤生长及延长平均生存时间(40天vs＞60天)，并100％小鼠(5/5)的肿瘤完全消失。提示:CpG和抗CD40抗体预处理的B/DRs加强免疫能增强B/DRs疫苗的抗肿瘤效果;
　　3.2检测各组免疫应答发现:当体外用EG7-DRs再刺激后，与两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的B细胞组相比，两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的、负载DRs的B细胞组分泌的IFN-γ大大增加（230pg/ml vs820pg/ml）;与两次输注负载DRs的B细胞组相比，两次输注CpG和抗CD40抗体预处理的、负载DRs的B细胞组分泌的IFN-γ又有进一步增加(420pg/ml vs820pg/ml);当用无关DRs或CM刺激时，各组小鼠产生的IFN-γ水平较低甚至几乎为零。
　　结论:
　　1.B/DRibbles加强免疫能增强DRibbles疫苗诱导的免疫应答及其抗肿瘤作用;
　　2.联合CpG和抗CD40抗体预处理的B/DRibbles疫苗能进一步增强B/DRibbles疫苗诱导的免疫应答和抗肿瘤作用。

目录

声明

摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

综述 自噬调节抗原递呈细胞功能的研究进展

前言

一、研究背景

二、研究目的及内容

三、研究的创新点及意义

第一部分 B／DRibbles疫苗诱导效应T细胞应答及其抗肿瘤作用的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 B／DRibbles疫苗的优化策略

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介