新型K开放剂Iptakalim对原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响

摘要

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是许多肺部疾病发展为慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程。肺动脉高压的病理生理基础是肺小动脉平滑肌细胞收缩、增殖及肺小动脉重构。研究表明，肺动脉平滑肌细胞膜钾通道与肺动脉收缩及增殖密切相关。钾通道功能下降激活L-钙通道，使细胞内Ca2+([ca2+]cyt)浓度升高，肺动脉平滑肌细胞收缩；同时增殖细胞核抗原(PCNA)、转录生长因子-β1(TGF-β1)等增殖因子增加，凋亡因子减少，促进肺动脉平滑肌细胞增殖。 肺动脉平滑肌细胞膜至少存在四种钾通道：(1) 电压依赖性钾(Kv)通道，(2)Ca2+激活性钾(Ka)通道，(3)ATP敏感性钾(ATP)通道，即内向整流性钾(Kir)通道，(4)二孔区钾(K2P)通道。 缺氧时，KATP通道代偿性开放是机体重要的代偿机制。持续缺氧导致肺血管内皮细胞合成、分泌血管活性物质失衡，内皮素-1(ET-1)、血管紧张素Ⅱ(ANG Ⅱ)等缩血管物质增加，一氧化氮(NO)、前列腺素I2(PGI2)等舒血管物质减少。这些物质与肺动脉平滑肌细胞膜KATP通道正偶联或负偶联，使钾通道功能下降，细胞膜去极化，肺动脉平滑肌细胞收缩。持续肺血管收缩刺激血管增生、重构、产生肺动脉高压及右心室肥厚。因此，KATP通道在肺动脉高压形成中处于关键环节，成为研发治疗肺动脉高压新型药物的重要靶分子。 新型KATP开放剂Iptakalim对SUR2B/Kir6.1靶向性更强。动物研究显示，Iptakalim可提高肺动脉平滑肌细胞外向性钾电流、抑制低氧性肺血管收缩及增殖、降低低氧大鼠肺动脉压力，还能逆转肺血管和气道重构、抑制右心室肥厚、有效预防和治疗肺动脉高压。考虑到人与动物间的物种差异，Iptakalim对人肺动脉平滑肌细胞的作用可能存在差异。目前，包括本研究在内的系列研究正在展开。本实验以ET-1及低氧诱导原代培养人肺动脉平滑肌细胞，运用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcriptive polymerase chainreaction，RQ-RT-PCR)技术，研究Iptakalim对人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响，以揭示肺动脉高压发生发展的分子生物学机制，并为Iptakalim研发成具有自主知识产权的临床治疗新药积累实验基础。 第一部分Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响 目的:研究新型KATP开放剂Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响，以探讨Iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制。 方法:分离手术标本正常人肺组织3～4级肺小动脉，原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入ET-1、不同浓度Iptakalim(0.1μM、1μM、10 μM)及Glyburide(0.1μM、1μM、10 μM)继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞总RNA，逆转录为cDNA，以RQ-RT-PCR法检测各组细胞SUR2B/Kir6.1mRNA表达量。 结果:ET-1组SUR2B mRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的抑制作用，提高SUR2BmRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim的作用，减少SUR2B mRNA表达量。各组Kir6.1 mRNA表达量无统计学差异。 结论:新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖性拮抗ET-1的作用，增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中SUR2B亚基mRNA表达量，提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达、缓解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。 第二部分Iptakalim对低氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响 目的:研究新型KATP开放剂Iptakalim对低氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响，以探讨Iptakalim治疗肺动脉高压的分子生物学机制。 方法:分离手术标本正常人肺组织3～4级肺小动脉，原代培养肺动脉平滑肌细胞。分别加入不同浓度Iptakalim(0.1 μM、1 μM、10 μM)及Glyburide(0.1 μM、1μM、10μM)于低氧环境下(O2 5％， CO2 5％，N2 90％)继续孵育细胞24小时。以Trizol法抽提细胞总RNA，逆转录为cDNA，以RQ-RT-PCR法检测各组细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达量。 结果:低氧组SUR2BmRNA表达量较正常组明显减少。Iptakalim呈浓度依赖性拮抗低氧的抑制作用，提高SUR2B mRNA表达量。Glyburide呈浓度依赖性拮抗Iptakalim作用，减少SUR2B mRNA表达量。各组细胞Kir6.1 mRNA表达量无统计学差异。 结论:新型KATP开放剂Iptakalim呈浓度依赖性拮抗低氧的作用，增加原代培养人肺动脉平滑肌细胞KATP通道中SUR2B亚基mRNA表达量，提示Iptakalim通过增加人肺动脉平滑肌细胞KATP通道表达、缓解肺动脉平滑肌痉挛、增殖治疗肺动脉高压。

目录

论文说明：中英文对照表

声明

前言

第一部分Iptakalim对ET-1诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分Iptakalim对缺氧诱导的原代培养人肺动脉平滑肌细胞SUR2B/Kir6.1 mRNA表达的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

小结

致谢

硕士在读期间发表或完成的论著及综述：

附综述一 钾通道在肺血管平滑肌分中分布及作用特点

综述二：磷酸二酯酶抑制剂与呼吸道疾病