HepG2肝癌细胞及正常人肝细胞(Hl-7702)的甲基化谱及其mRNA表达谱关联研究

摘要

在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5*-CG-3*序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5*端的非编码区，并成簇存在。获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据，对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。本论文利用高通量测序技术，对肝癌细胞HepG2和正常人肝细胞HL-7702进行全基因组甲基化、miRNA测序，通过生物信息学分析获得全基因组甲基化表达水平和mRNA表达谱，并进行mRNA-甲基化的关联分析，试图更全面的了解肿阐明甲基化在调节基因表达上与肿瘤发生的关系。本课题目前主要完成了以下研究内容:
　　1.我们对高通量测序结果中HepG2细胞和HL-7702细胞的mRNA结果进行了序列比对、差异表达分析及功能注释。我们对两个样本中的mRNA表达水平进行了定量和归一化，比较样本间的差异表达情况，挑选出表达差异明显的mRNA。然后对挑选出的差异明显的基因进行功能注释和通路分析，发现在表达上调的基因中，有部分基因跟细胞周期、细胞分裂、MAPK、JUN等功能相关。同时对上调的mRNA做通路分析，发现两条信号通路hsa04110:Cell cycle，hsa04115:p53signaling pathway与细胞凋亡相关。在表达下调的基因中，存在大量与细胞凋亡、细胞周期、转录功能相关的基因，通路分析发现三条与细胞凋亡相关的信号通路:hsa04210:Apoptosis、hsa04310:Wnt signaling pathway、hsa04115:p53signaling pathway
　　2.我们对高通量测序结果中HepG2细胞和HL细胞的甲基化结果进行了质量评估和差异分析，主要包括样本制备、测序流程、质量评估、差异表达、功能注释、关联分析等。我们对HepG2细胞和HL细胞的甲基化数据进行注释和甲基化水平分析，发现得到的CpG位点部分是未注释过的新甲基化位点，而有注释结果的CpG位点主要位于CpG岛上。在得到的甲基化位点的功能区域注释中显示，大部分的甲基化位点位于基因区域，位于内含子区域和外显子区域的甲基化位点紧随其后。同时，将上述注释到启动子区域的差异甲基化区域定位到基因上，共得到3193个基因，结合上一章中差异表达的mRNA做关联分析，最终得到174个表达上调的mRNA和409个表达下调的mRNA。对得到的差异表达的mRNA进行功能注释和KEGG通路分析结果显示，大部分基因与细胞的生长发育、凋亡不相关，仅有很少一分部分与细胞转录调控、细胞发育相关的基因呈现表达下调的现象，其具体机理还需要进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 前言

1．1．1 研究背景

1．1．2 基于高通量测序的RNA组学研究

1．1．3 基于高通量测序的全基因组甲基化研究

1．2 研究内容

1．3 研究目的及意义

第二章 HepG2肝癌细胞及HL-7702正常人肝细胞的mRNA表达谱分析

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 细胞培养及处理

2．2．2 Total RNA提取

2．2．3 测序流程

2．2．4 mRNA测序数据的生物信息学分析

2．2．5 mRNA功能注释和KEGG通路分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 差异表达的mRNA统计

2．3．2 表达上调的mRNA功能注释和KEGG通路分析

2．3．3 表达下调的mRNA功能注释和信号通路分析

2．4 本章小结

第三章 HepG2肝癌细胞及HL-7702正常人肝细胞的甲基化水平分析及关联分析

3．1 引言

3．2 试验材料与方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 Illumina Hiseq2000测序

3．2．3 测序数据质量评估

3．2．4 测序数据比对

3．2．5 差异甲基化分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 测序数据质量评估

3．3．2 测序数据比对

3．3．3 覆盖深度分析

3．3．4 差异甲基化区域分析

3．3．5 甲基化与基因表达关联分析

3．4 本章小结

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

致谢

参考文献

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