Ezrin相关蛋白网络在人精子获能过程中的功能研究

摘要

受精是一个新个体产生的标志，是指精子和卵子自发融合成为受精卵的过程，要完成这一过程必须具备一定的条件，精子获能就是其中之一。获能是指精子获得使卵细胞受精的能力，是精子在自然状态下完成受精过程的一个必需条件。哺乳动物的精子在受精前都要经历获能过程。在精子获能过程中，对于精子质膜的修饰改变是这一过程的一个关键事件。但是迄今为止，对于这一重要事件分子机制的研究结果还不多，远不能阐明这一过程。 Ezrin蛋白是ERM蛋白家族的成员之一，也是该家族中被研究最多的蛋白。在体细胞中的大量研究显示，ezrin是细胞皮质骨架蛋白与细胞质膜固有膜蛋白之间的衔接蛋白，它的主要作用是通过对骨架蛋白与膜蛋白的衔接作用，引起细胞膜表面结构的重构，从而介导包括细胞黏附、变形、微绒毛形成等一系列的细胞事件。不仅如此，活化的ezrin还能够和Rho解离抑制因子--RhoGDI一起促进细胞表层骨架蛋白的形成，从而使actin聚合形成F-actin。因此，在体细胞中就存在一个由ezrin、actin、RhoGDI、Rho蛋白以及质膜蛋白共同形成的蛋白网络体系。这个蛋白网络的主要作用就是对细胞膜的表面结构进行组装。 本实验室在前期研究工作中发现，ezfin和RhoGDIl表达于人睾丸组织中，那么，会不会前述与ezrin相关的蛋白网络体系也能在精子中发挥功能呢?因为在精子获能过程中也存在膜重构的现象。我们推测，这个网络体系可能作用于精子获能过程中的膜重构。针对这一问题开展了以下研究：(1)用ERM家族磷酸化位点的抗体行不同获能状态精子蛋白的Western Blot实验，结果显示在精子获能过程中，ezrin第567位苏氨酸发生了磷酸化修饰，这说明ezrin在获能过程中被活化。推测活化后的ezrin可以与下游一系列蛋白通过直接或间接相互作用参与膜的重构，故运用一系列免疫共沉淀试验进行验证。(2)用免疫共沉淀方法比较获能前后ezrin与RhoGDll相互作用情况，结果显示，两者的相互作用在获能后增加；运用二维电泳结合银染和磷酸化染色方法，结果显示，RhoGDll自身还在获能过程中发生了磷酸化修饰，前述两个结果均可导致RhoGDll自Rho蛋白解离下来。对后者用免疫共沉淀的方法进行验证，结果符合预想，RhoGDll与RhoA的相互作用在获能后减弱。这一结果提示RhoA可参与下游一系列通路导致F-actin形成。(3)对于这一系列事件的最终结果用F-actin特异性染料。Texas Red-Phalloidin染色进行分析，结果显示，获能后，精子的F-actin染色尤其是头部的染色明显增强。说明获能过程中actin聚合。(4)据体细胞中的研究，ezrin可以和F-actin相互作用，故运用Co-IP方法对ezrin和F-actin的相互作用进行分析，结果显示获能后ezrin与F-actin的相互作用增强。这与体细胞中的现象类似，因此我们推测ezrin还可通过其氨基端与膜相互作用。(5)筛选了一个精子膜蛋白cd44，同样运用免疫共沉淀的方法比较其与ezrin相互作用情况，结果显示，ezrin在获能后与cd44相互作用增加，且ezrin不仅可以和ed44的未修饰形式相互作用，还可与其糖基化修饰形式相互作用。(6)最后，分析ezrin和actin在获能中可能的功能，分别用ezrin和actin.抗体对获能和顶体反应进行阻断，结果显示，ezrin和actin抗体能够阻断精子获能但对于顶体反应则没有影响。 总之，本研究为人精子获能分子机制提出了一个新的假说，即在人精子获能过程中，ezrin、RhoGDll、actin、RhoA及膜蛋白可以通过相互作用形成一个蛋白网络体系，这样的网络可以调节获能过程中精子质膜重组、精子膜蛋白的重新分布，从而促进精子与卵子的受精过程。

目录

声明

前 言

一、精子获能的概述

二、精子质膜与获能

三、Ezrin与actin骨架形成和细胞膜的重构

四、精子体外获能的方法及获能状态的评价

五、本课题研究内容

实验材料与方法

一、实验材料

二、实验方法与步骤

实验内容与结果

一、EZRIN与RhoGDI1在人精子中的表达及定位

二、Ezrin及RhoGDI1在获能过程中与F-actin的形成相关

三、获能过程中ezrin与F-actin和膜蛋白相互作用

四、Ezrin及actin抗体阻断获能及顶体反应

讨 论

参考文献

附录 在读期间发表及撰写文章

致 谢