胰石蛋白减轻胰腺星状细胞对胰岛β细胞的毒性效应

摘要

目的:病理研究显示，2型糖尿病胰岛内存在纤维化，胰腺星状细胞是胰岛纤维化的主要始动和效应细胞，并且对胰岛β细胞具有直接损伤作用。胰石蛋白/再生蛋白(Pancreatic stone protein/regeneration protein，PSP/reg)是再生基因家族的重要成员之一，与胰腺细胞的增殖密切相关。有研究显示，该蛋白促进胰岛β细胞增殖及功能，并且可抑制胰腺星状细胞活化及其致纤维化能力。本实验探讨PSP/reg对胰腺星状细胞(Pancreatic Stellate Cell，PSC)胰岛β细胞毒性效应的影响。
　　方法:分离培养美国癌症研究所(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠的PSC，在含或不含有PSP/reg的培养液中培养24小时，收集PSC上清(PSC supernatant，PSC-SN)，将MIN-6小鼠胰岛β细胞株分别培养在:①无血清培养基、(②含0/30/100/200/300 ng/ml PSP/reg的无血清培养基、③PSC-SN、④PSP/reg干预的PSC-SN(PSP-PSC-SN)、⑤含有100 ng/ml PSP/reg的PSC-SN(PSP+PSC-SN)中24小时。CCK-8比色法观察不同处理组小鼠胰岛β细胞存活率;流式细胞术检测AnnexinⅤ-FITC&PI双染细胞比例;葡萄糖刺激的胰岛素释放(Glucose Stimulated Insulin Secretion，GSIS)试验;胰岛素ELISA试剂盒检测上清胰岛素浓度;Western blot法检测P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达。
　　结果:1.CCK-8法检测PSP/reg组MIN-6小鼠胰岛β细胞活力百分比高于对照组，流式细胞术分析结果显示两组AnnexinⅤ-FITC&PI双染细胞比例无明显差异，GSIS试验结果显示PSP/reg组葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度高于对照组，WB检测PSP/reg组P62蛋白含量低于对照组、LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于对照组;
　　2.CCK-8法检测PSC-SN组MIN-6小鼠胰岛β细胞活力百分比低于对照组，流式细胞术分析结果显示PSC-SN组AnnexinⅤ-FITC&PI双染细胞比例高于对照组，GSIS试验结果显示PSC-SN组葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度低于对照组，WB检测PSC-SN组P62蛋白含量低于对照组、LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于对照组;
　　3.CCK-8法检测PSP-PSC-SN组MIN-6小鼠胰岛β细胞活力百分比高于PSC-SN组，流式细胞术分析结果显示PSP-PSC-SN组AnnexinⅤ-FITC&PI双染细胞比例低于PSC-SN组，GSIS试验结果显示PSP-PSC-SN组葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度高于PSC-SN组，WB检测PSP-PSC-SN组P62蛋白含量高于对照组、LC3Ⅱ/Ⅰ比值低于对照组;
　　4.CCK-8法检测PSP+PSC-SN组MIN-6小鼠胰岛β细胞活力百分比高于PSC-SN组，流式细胞术分析结果显示PSP+PSC-SN组AnnexinⅤ-FITC&PI双染细胞比例低于PSC-SN组，GSIS试验结果显示PSP+PSC-SN组葡萄糖刺激的胰岛素释放浓度高于PSC-SN组，WB检测PSP+PSC-SN组P62蛋白含量高于对照组、LC3Ⅱ/Ⅰ比值低于对照组。
　　结论:在一定的浓度范围内，PSP/reg浓度依赖性地促进MIN-6细胞存活、胰岛素释放作用及MIN-6细胞的自噬水平，过高浓度的PSP/reg可导致MIN-6细胞的过度自噬，对MIN-6细胞的存活及胰岛素释放产生抑制作用; PSC-SN抑制MIN-6细胞增殖及胰岛素释放，促进MIN-6细胞凋亡，并诱导MIN-6细胞的过度自噬;PSP/reg促进PSC-SN干预的MIN-6细胞存活及胰岛素释放，减少PSC-SN诱导的MIN-6凋亡及过度自噬;此外，PSP/reg干预后的PSC-SN(PSP-PSC-SN)对MIN-6活力及胰岛素释放的的抑制、促进MIN-6凋亡及过度自噬等作用减弱。综上所述，PSP/reg本身具有增加胰岛β细胞活力及功能等作用，还可减轻PSC-SN对胰岛β细胞的损伤，此外，PSP/reg可作用于PSC，抑制其致胰岛β细胞损伤的能力，间接发挥胰岛β细胞的保护作用。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

前言

文献综述

胰腺星状细胞与胰岛纤维化研究进展

自噬与胰岛β细胞

一、材料与方法

1．试剂与耗材

1．1 动物和细胞

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂盒

1．4 主要抗体

1．5 实验器材

2．实验方法

2．1．主要试剂配制

2．2 细胞培养

2．3 细胞总蛋白提取及定量

2．4 免疫蛋白印迹

2．5 CCK-8检测细胞存活率

2．6 流式细胞术分析凋亡

2．7 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验

2．8 胰岛素检测

2．9 统计学分析

二、结果

1．小鼠PSC分离及鉴定

2．PSP/reg对PSC细胞活力的影响

3．PSC-SN对MIN-6细胞活力、凋亡、胰岛素分泌及自噬水平的影响

4．PSP／reg对MIN-6细胞活力、凋亡、胰岛素分泌及自噬水平的影响

5．PSC-SN环境下，PSP/reg对MIN-6细胞活力、凋亡、胰岛索分泌及自噬水平的影响

6．PSP-PSC-SN对MIN-6细胞活力、凋亡、胰岛素分泌及自噬水平的影响

三、讨论

四、结论

参考文献

致谢