金标免疫渗滤法检测类风湿性关节炎自身抗体的研究

摘要

胶体金标记技术的建立催生了两种经典的免疫学检测方法，斑点金免疫渗滤(DIGFA)和胶体金免疫层析技术(GICA)，其中DIGFA由于具有快速、结果可直接判读、可单人份检测、结果稳定等优点逐渐成为开发各类快速诊断试剂的技术基础，一系列针对临床、食品等多个领域的DIGFA被建立和应用。类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，晚期关节多发生畸形难以治愈，早期诊断对疾病的控制尤为重要，大量研究已经表明在临床症状出现好几年前患者血清中就会出现特异的自身抗体，对这些自身抗体的检测对RA的早期诊断非常有利。
　　本文拟建立检测RA两种自身抗体的DIGFA，旨在简化检测操作、降低检测成本、在样本量少的情况下可快速开展检测。为此，首先通过与欧蒙试剂盒对比及检测临床确定的血清对待检抗体特异的抗原进行了筛选制备，采用链酶亲和素-生物素结合方式将环瓜氨酸肽(CCP)与载体蛋白进行偶联，优化了新的含18个氨基酸的环肽序列;确定了较稳定的类风湿因子(RF)特异抗原的原料来源，同时优化了特异性高的HRP标记F(ab')2片段作为酶标二抗，并比较了兔IgG、人IgG、Fc片段几种常用于RF检测的抗原性能。
　　接着，本文制备了抗自身抗体的胶体金探针，对各反应参数进行了优化，确定了较好的偶联pH在8.2～8.5之间(7μL K2CO3(5％)/mLAu)，最小偶联蛋白量为22μg/mLAu，最适大分子稳定剂是BSA（免疫级）和PEG-20K，较优洗涤纯化缓冲液是Tris-HCl(pH8.2)，最后优化了探针冻干的最佳保护剂为甘露醇。
　　最后，将前两章制各的抗原和探针应用于DIGFA的建立，对影响检测的多个因素进行了优化，确定了RIgG最适稀释液是Tris-HCl(pH8.2)，样品下渗速度是1.4～3.3μL/s，大分子封闭剂是BSA，洗涤条件是PBST(pH7.4，1％ Tween-20)，同时发现PEG和Tween对斑点显色有一定增强作用，用该试剂检测部分临床血清，显示了良好的检测效果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 类风湿性关节炎

1．1．1 类风湿性关节炎的病理、发病率及诊断标准

1．1．2 血清学指标

1．1．3 RF和抗CCP抗体的检测

1．2 金标免疫渗滤法

1．2．1 临床免疫学检测技术

1．2．2 金标免疫渗滤法(DIGFA)在生物检测中的应用

1．3 本文研究内容

参考文献

第二章 抗CCP抗体及RF相应抗原的筛选制备

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 CCP的ELISA检测

2．2．4 BSA-CCP偶联物的制备及测定

2．2．5 SA-biotin-CCP的免疫活性

2．2．6 CCP及其偶联物的临床血清检测效果

2．2．7 RF的ELISA检测步骤

2．2．8 RF相应抗原变性产物的制备

2．2．9 血清热灭活

2．3 结果与分析

2．3．1 CCP的ELISA检测活性

2．3．2 BSA-CCP偶联物的制备及测定

2．3．3 SA-biotin-CCP的制备及免疫活性

2．3．4 不同序列CCP检测效果比较

2．3．5 R-IgG作为抗原检测RF

2．3．6 RF检测用酶标二抗的优化

2．3．7 不同抗原包被检测RF的综合比较

2．4 本章小结

参考文献

第三章 胶体金探针的制备及优化

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 抗体与胶体金结合最佳pH测定

3．2．4 最小蛋白用量的确定

3．2．5 探针封闭洗涤大分子保护剂确定

3．2．6 金探针洗涤液最佳pH的确定

3．2．7 金探针洗涤液最适缓冲液的确定

3．2．8 金探针冻干粉的表征

3．3 结果与讨论

3．3．1 抗体与胶体金结合最佳pH测定

3．3．2 最小蛋白用量的确定

3．3．3 金探针封闭洗涤最适大分子稳定剂

3．3．4 金探针洗涤纯化最佳pH及缓冲溶液确定

3．3．5 金探针的表征

3．3．6 金探针的保存

3．4 本章小结

参考文献

第四章 金标免疫渗滤法的建立及优化

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器及耗材

4．2．3 SA-biotin-CCP及R-IgG的包被

4．2．4 最佳液体下渗速度测定

4．2．5 封闭条件优化

4．2．6 洗涤条件优化

4．2．7 吐温及PEG对检测灵敏度的影响

4．3 结果与讨论

4．3．1 SA-biotin-CCP及R-IgG的包被

4．3．2 最佳液体渗滤速度测定

4．3．3 不同大分子物质的封闭作用

4．3．4 表面活性剂成分及浓度确定

4．3．5 PEG及Tween-20对检测灵敏度的影响

4．3．6 抗CCP抗体及RF的金标渗滤检测效果

4．4 本章小结

参考文献

第五章 总结与展望

致谢