下调ZEB1表达抑制黑色素瘤干细胞的致瘤性和肺转移研究

摘要

恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是来源于黑色素细胞的一种恶性肿瘤。在过去的20多年中，世界范围内恶性黑色素瘤的发病率呈逐步增高的趋势。皮肤是恶性黑素色瘤的主要发病部位，占皮肤恶性肿瘤的死亡率约70％，也可起源于眼、鼻腔等处，其高度侵袭与转移的能力是恶性黑色素瘤患者死亡的主要原因，早期可转移至肺、脑等部位，晚期随体循环扩散至全身。而上皮-间充质转换(epithelialmesenchymal transition，EMT)在其中扮演着重要角色， EMT被认为是启动肿瘤侵袭转移的重要事件。研究表明，历经EMT的恶性黑色素瘤细胞能从肿瘤的原发灶逃离，侵袭到周围其他组织，经过血液或淋巴途径到达更远处的器官形成转移灶。新近研究还发现，有EMT表型的恶性黑色素瘤细胞更具耐药性、免疫抑制及类干细胞等特性。在EMT的发生发展过程中最主要的调控对象是E-钙黏着蛋白(E-cadherin)。该蛋白是维持上皮细胞特性的重要分子，E-cadherin的丢失是EMT的一个重要特征，若E-cadherin表达下降，细胞则会呈现许出多非上皮细胞的特征，如细胞极性丢失，细胞间的粘附性降低，转变成更易发生转移的间质细胞，而表达波形蛋白（Vimentin）上调，这些蛋白表达改变是EMT的一个重要标志。因此，探究EMT的发生和调控机制，对于寻找治疗肿瘤细胞转移的靶点有重要意义。
　　随着分子生物学的发展，研究者发现肿瘤组织中有极少数细胞具有类于细胞的特性:能无限增殖、不断分化，对化疗、放疗不敏感，而这些细胞成为肿瘤发生、侵袭转移和复发的关键细胞，即肿瘤干细胞(tumor stem ceils，TSCs)或癌干细胞(cancer stem cells，CSCs)。近来对肿瘤发生发展过程的研究表明，锌指结合蛋白（1zinc finger E-box-binding protein1，ZEB1）在肿瘤转移过程中发挥着重要作用。ZEB1是锌指结构转录因子中的E盒结合锌指蛋白，它不仅能调节EMT的发生和发展，还能通过调节细胞周期、细胞凋亡、衰老、侵袭转移和间质血管生成等，进而调节肿瘤的进展。本课题组前期实验结果显示:降低B16F10细胞中ZEB1的表达，可在一定程度上降低B16F10细胞在体外的克隆形成能力、增殖能力、耐药性、侵袭转移能力及体内致瘤能力，但对B16F10细胞中CSCs的影响如何，期待进一步探讨。正因如此，本研究选择小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞中CD133+ CD44+CSCs作为研究对象，将其从B16F10细胞中分离，探讨下调ZEB1的表达对CD44+CD133+CSCs的致瘤性和肺转移的影响，从而为恶性黑色素瘤的治疗提供新的思路。
　　目的:
　　探讨下调黑色素瘤CSCs中ZEB1的表达对其致瘤性和肺转移的影响，为寻找黑色素瘤新的治疗靶点提供实验依据。
　　方法:
　　1.将构建好的靶向鼠ZEB1基因的pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA干扰质粒通过脂质体转染B16F10细胞，并通过G418筛选稳定转染细胞株。
　　2.用免疫磁选技术从稳定转染pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10克隆中分离获取ZEB1-shRNA2CD133+CD44+CSCs以及scramble-shRNA CD133+CD44+CSCs;从B16F10细胞中分选出CD133+CD44+CSCs。
　　3.通过划痕实验、侵袭性实验，体内致瘤性、荷瘤鼠生存实验及肺转移实验，综合分析下调ZEB1表达后对B16F10 CD44+CD133+ CSCs的致瘤性和肺转移的影响。
　　4.用2×104 B16F10 CD44+CD133+CSCs、ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs分别攻击C57BL/6小鼠，通WesternBlotting实验和免疫组化实验分别检测瘤组织中EMT相关蛋白ZEB1，E-cadherinN-cadherin及Vimentin的表达。
　　结果:
　　1.分离出经G418筛选出稳定转染pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA的B16F10细胞克隆;
　　2.用免疫磁选技术成功分离出ZEB1-shRNA CD133+CD44+CSCs、scramble-pSUPER-EGFP CD133+CD44+CSCs以及B16F10 CD133+CD44CSCs;划痕实验、侵袭性实验、小鼠体内致瘤性和肺转移实验结果显示:B16F10 CD44+CD133+CSCs及scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs的侵袭性和转移性以及致瘤性均高于ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs，差异有显著性意义(P＜0.01)。
　　3.qRT-PCR法、Western Blotting及免疫组化检测瘤组织中EMT相关蛋白显示:ZEB1-shRNA CD44+CD133+CSCs的靶基因ZEB1表达减低，间质型蛋白Vimentin和N-cadherin表达下降，而上皮型蛋白E-cadherin的表达升高;肺组织黑色素瘤转移结节显著减少，与B16F10 CD44+CD133+CSCs和scramble-pSUPER-EGFP CD44+CD133+CSCs组相比，差异有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01）。
　　结论:
　　下调黑色素瘤B16F10 CD44+CD133+CSCs中ZEB1的表达，可在一定程度上降低其在体外的增殖能力、克隆形成能力，侵袭力及小鼠体内致瘤性和抑制肺转移能力，提示ZEB1可作为黑素瘤CSCs治疗的新靶点。

目录

声明

摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

绪论

综述 黑色素瘤及其CSCs上皮间质转化的研究概况

第一部分：下调ZEB1对B16F10 CSCs体外生物学特性的影响

引言

材料和方法

实验结果

讨论

第二部分 下调ZEB1对B16F10 CSCs体内致瘤性及其肺转移的研究

引言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

致谢

参考文献

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