生物材料表面吸附蛋白质介导细胞粘附和生长的生物学信号通路研究

摘要

生物相容性是生物材料研究中的关键问题，而细胞在材料表面的粘附和生长情况是生物相容性评价的重要内容。通常认为生物材料植入体内或进行体外实验时，首先在材料表面发生蛋白质的吸附，然后发生细胞在材料表面的粘附和生长。而基因表达谱芯片和PCR芯片技术能帮助人们了解细胞内基因的表达情况，深入研究与细胞粘附和生长相关的生物学通路，从分子水平解释材料与细胞之间的相互作用。
　　本论文的目的是:(1)利用基因表达谱芯片研究壳聚糖膜和胶原蛋白/壳聚糖膜表面PC12细胞的基因表达情况，并与本课题组前期的吸附蛋白质的蛋白质组学结果进行联合分析，研究材料表面吸附蛋白质对细胞基因组学的影响;(2)利用信号通路PCR芯片研究无涂层/氮化钛涂层镍钛合金对内皮细胞相关通路中基因表达情况，对本课题组前期发现的细胞粘附和生长过程中重要生物学信号通路进行验证，研究材料表面吸附蛋白质对细胞粘附的影响，综合上述两部分结果，对细胞粘附和生长的重要生物学信号通路进行研究，阐述材料表面吸附蛋白质介导细胞粘附和生长的分子机理。
　　本论文的具体工作如下:
　　1.利用匀胶法制备壳聚糖膜和胶原蛋白/壳聚糖膜，利用吖啶橙染色法和CCK-8实验分别测定PC12细胞在这两种材料和正常对照组表面的细胞形态和存活率，结果发现在4h和24h两个时间点，胶原蛋白/壳聚糖膜更有利于PC12细胞的粘附和形态铺展;两种材料表面培养4h时细胞存活率差异较小，在24h时胶原蛋白/壳聚糖膜表面细胞存活率明显大于壳聚糖膜组，说明与壳聚糖膜相比，胶原蛋白/壳聚糖膜促进PC12细胞的粘附和生长。
　　2.利用基因表达谱芯片研究壳聚糖膜和胶原蛋白/壳聚糖膜表面PC12细胞生长4h和24h后基因表达情况，结果发现壳聚糖膜组差异表达基因数量较多，通过RT-PCR实验检验Pak1、Actn1、Bcar1、Akt1四个基因的表达情况与基因表达谱芯片实验结果一致。此外，利用信号通路PCR芯片分别检测无涂层/氮化钛涂层镍钛合金表面人脐静脉内皮细胞培养4h和24h后，“TGFβ/BMP信号通路”和“细胞骨架调控信号通路”中相关基因的表达，结果表明，在这两条信号通路中氮化钛涂层镍钛合金表面内皮细胞发生差异表达的基因更多。
　　3.利用DAVID功能注释工具对壳聚糖膜和胶原蛋白/壳聚糖膜表面PC12细胞生长4h和24h后的差异表达基因进行GO功能分类分析，结果表明两种材料主要参与生物学过程为细胞过程、代谢相关过程、细胞分化和发育等;分子功能主要包括核苷酸、DNA、蛋白质等相关的分子功能等;细胞组分主要包括细胞内相关的细胞组分功能、细胞膜和细胞外相关的功能等。差异表达基因的生物学信号通路分析表明，材料与细胞作用后，主要影响细胞的粘着斑信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控信号通路、胰岛素信号通路、EGFR1信号通路。与本课题组前期吸附蛋白质的蛋白质组学分析结果进行联合分析，发现壳聚糖膜和胶原蛋白/壳聚糖膜表面吸附的血清蛋白质作为配体与细胞表面受体结合后，通过细胞骨架跨膜连接将细胞外信号传递进入细胞内，激活粘着斑、MAPK、PI3K等信号通路，参与粘着斑和肌动蛋白细胞骨架的组装等过程，通过以上生物学信号通路相互作用，胶原蛋白/壳聚糖膜更有利于PC12细胞的粘附和生长。
　　4.对无涂层/氮化钛涂层镍钛合金表面人脐静脉内皮细胞生长4h和24h后的差异表达基因进行生物信息学分析，结果发现“TGFβ/BMP信号通路”和“细胞骨架调控信号通路”两条信号通路发生激活。与本课题组前期蛋白质组学和基因组学结果联合分析，发现在细胞粘附阶段，通过激活TGFβ信号通路增加整联蛋白α/β亚基基因的表达，或通过含RGD序列的蛋白质与活化的整联蛋白结合，激活粘着斑通路和肌动蛋白细胞骨架调控信号通路，进而促进细胞的粘附;在细胞生长和增殖阶段，氮化钛涂层镍钛合金可有效减少无涂层镍钛合金的镍离子溶出，激活肌动蛋白细胞骨架调控信号通路、粘着斑信号通路、能量代谢相关信号通路、炎症反应信号通路，抑制细胞凋亡信号通路，改善细胞的功能。
　　综合上述材料与细胞的相互作用研究结果，发现粘着斑信号通路、细胞骨架调控信号通路等是影响细胞在材料表面的粘附和生长的重要信号通路。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 壳聚糖、胶原蛋白和镍钛合金在生物材料中的应用

1．1．1 生物材料概述

1．1．2 壳聚糖在生物材料中的应用

1．1．3 胶原蛋白／壳聚糖混合材料在生物材料中的应用

1．1．4 镍钛合金在生物材料中的应用

1．2 壳聚糖、胶原蛋白和镍钛合金的生物相容性研究

1．2．1 生物材料的生物相容性研究

1．2．2 壳聚糖的生物相容性研究

1．2．3 胶原蛋白／壳聚糖混合材料的生物相容性研究

1．2．4 镍钛合金的生物相容性研究

1．3 基因芯片技术及其在生物相容性研究中的应用

1．3．1 基因芯片技术简介

1．3．2 基因表达谱芯片技术及其在生物相容性研究中的应用

1．3．3 PCR芯片技术及其在生物相容性研究中的应用

1．4 基因芯片实验数据的生物信息学分析

1．4．1 生物信息学分析简介

1．4．2 生物信息学分析在基因表达谱芯片实验数据分析中的应用

1．4．3 生物信息学分析在PCR芯片实验数据分析中的应用

1．5 本论文的主要内容

参考文献

第二章 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜的制备和生物相容性研究

2．1 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜的制备

2．1．1 材料与设备

2．1．2 实验方法

2．2 PC12细胞在壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜表面细胞形态学观察

2．2．1 PC12细胞的培养

2．2．2 PC12细胞形态学观察

2．3 PC12细胞在壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜表面细胞存活率检测

2．3．1 实验原理

2．3．2 实验方法和步骤

2．3．3 实验结果和讨论

2．4 本章小结

参考文献

第三章 材料与细胞作用的基因芯片研究及实验结果的验证

3．1 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜与PC12细胞作用的基因表达谱芯片实验

3．1．1 基因表达谱芯片样品的制备

3．1．2 基因表达谱芯片实验步骤

3．1．3 基因表达谱芯片实验结果与讨论

3．2 基因表达谱芯片实验结果的RT-PCR验证

3．2．1 RT-PCR实验原理

3．2．2 RT-PCR实验基因的选择

3．2．3 RT-PCR实验步骤

3．2．4 RT-PCR实验结果与讨论

3．3 无涂层／氮化钛涂层镍钛合金与内皮细胞作用的PCR芯片实验

3．3．1 人脐静脉内皮细胞的原代分离和传代培养

3．3．2 PCR芯片样品的制备

3．3．2 PCR芯片实验步骤

3．3．3 实验结果与讨论

3．4 本章小结

参考文献

第四章 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜与PC12细胞作用的基因表达谱芯片实验结果的生物信息学分析

4．1 基因表达谱芯片的生物信息学分析工具

4．1．1 DAVID功能注释工具简介及分析步骤

4．1．2 GenMAPP软件简介及分析步骤

4．2 GO功能分析结果及讨论

4．2．1 生物学过程(biological process)分析结果

4．2．2 分子功能(molecular function)分析结果

4．2．3 细胞组分(cell component)分析结果

4．3 生物学信号通路分析

4．4 基因组学与吸附蛋白质的蛋白质组学结果的联合分析

4．4．1 血清蛋白质在聚苯乙烯表面的吸附

4．4．2 聚苯乙烯表面吸附血清蛋白质的质谱鉴定

4．4．3 聚苯乙烯表面吸附蛋白质的生物信息学分析

4．4．4 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜表面吸附蛋白质的蛋白质组学结果简述

4．4．5 基因组学与吸附蛋白质的蛋白质组学结果的比较分析

4．4．6 壳聚糖膜和胶原蛋白／壳聚糖膜与PC12细胞作用的分子机理阐述

4．5 本章小结

参考文献

第五章 无涂层／氮化钛涂层镍钛合金和壳聚糖膜与内皮细胞作用的PCR芯片实验结果的生物信息学分析

5．1 TGF β／BMP信号通路中基因数据的生物信息学分析

5．2 细胞骨架调控信号通路中基因数据的生物信息学分析

5．3 信号通路PCR芯片与基因组学、蛋白质组学结果的联合分析

5．3．1 本课题组前期研究结果简述

5．3．2 信号通路PCR芯片与基因组学、蛋白质组学、RT-PCR实验结果的比较分析

5．3．3 无涂层／氮化钛涂层镍钛合金与内皮细胞作用的分子机理阐述

5．4 生物材料表面吸附蛋白质介导细胞粘附和生长的分子机理

5．5 本章小结

参考文献

第六章 总结与展望

6．1 论文总结

6．2 展望

致谢

在校期间发表论文情况

附录