原发性肝癌组织中经典HLAⅠ类等位基因特异性mRNA表达与肝癌细胞免疫逃逸相关性的研究

摘要

经典HLAⅠ类基因包括HLA-A、-B、-C三个座位，在人群中具有高度多态性，每个基因座位来自父母的两种等位基因产物共显表达于有核细胞表面，作为NK细胞和CTL的重要配体在调节免疫效应细胞功能中发挥着重要作用。
　　细胞毒性T细胞（CytotoxicityT lymphocyte，CTL）和自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞是免疫监视中最重要的两类效应细胞。HLAⅠ类分子在调节CTL和NK细胞的杀伤功能中均发挥了关键作用。CTL杀伤靶细胞时必须首先识别HLAⅠ类分子递呈的抗原肽，即T细胞的MHC限制性。因此经典HLAⅠ类分子表达缺失或降低有利于肿瘤细胞对CTL的免疫逃逸。NK细胞表面表达的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cellimmunoglobulin-like receptor，KIR)，与经典HLAⅠ类分子结合后抑制NK细胞的活化。因此HLAⅠ类分子表达上调或者不变有利于肿瘤细胞对NK细胞的免疫逃逸。
　　在绝大多数肿瘤中，经典HLAⅠ类分子表达缺失或降低，使得肿瘤细胞逃逸CTL杀伤;而在肝癌中发现，绝大多数肝癌组织的经典HLAⅠ类分子表达上调或不变。不同于外周血及其他脏器，肝脏中NK细胞的比例约30％，和T细胞数目相当，在NK细胞和CTL的双重免疫监视下，肝癌细胞必须具有独特的免疫逃逸机制。由于经典HLAⅠ类分子与KIR分子均具有高度多态性，不同等位基因编码的经典HLAⅠ类分子在调节NK细胞的杀伤活性中发挥了不同作用，因此，为了逃逸NK细胞和CTL的杀伤，肝癌中可能存在HLAⅠ类等位基因的选择性异常表达，即同一位点的两条等位基因表达水平变化不同。目前肝癌中经典HLAⅠ类等位基因表达水平的检测未见报道。
　　我们以原发性肝细胞癌为研究对象，首先对肝癌组织标本HLA基因和KIR基因进行分型，根据HLA分型结果设计HLA-A，-B，-C等位基因特异性定量PCR引物并验证，然后通过real time PCR对72例原发性肝癌组织样本进行HLAⅠ类等位基因mRNA表达的检测，结合KIR分型结果探讨肝癌细胞的免疫逃逸机制。研究结果如下:
　　1.本实验利用PCR-SBT方法完成HLA-A、-B、-C基因分型的样本例数分别为40例、31例、72例;PCR-SSP方法完成33例样本的12个KIR基因分型。
　　2.本实验完成HLA-A/C等位基因特异性定量PCR引物的设计与验证，共设计完成符合实验要求的20对HLA-C和4对HLA-A等位基因特异性定量PCR引物。
　　3.本实验完成80个HLA-A，62个HLA-B及144个HLA-C等位基因mRNA在肝癌和癌旁组织中表达水平的检测。结合本实验室前期的研究结果，共统计了144个HLA-A、140个HLA-B、144个HLA-C等位基因mRNA定量表达的结果，其中肝癌相比于癌旁， HLA-A等位基因上调表达36.11％，表达一致47.92％，下调表达15.97％; HLA-B等位基因上调表达26.43％，表达一致43.57％，下调表达30％;HLA-C等位基因上调表达27.78％，表达一致41.67％，下调表达30.55％。
　　4.作为抑制性KIR配体的HLA-Bw4表达上调比例(45.46％)高于非KIR配体的HLA-Bw6表达上调比例(20.95％)，具有统计学差异(P=0.006)。抑制性KIR配体HLA-C*03在NK细胞活性高的KIR-BX个体中上调比例(62.5％)高于KIR-AA个体中的上调比例(14.29％)，具有统计学差异(P=0.011)。
　　综合以上实验结果，我们设计并验证完成经典HLAⅠ类等位基因特异性的定量PCR引物，能够定量分析同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表达水平。在72例肝癌和癌旁组织中的研究结果表明，肝癌细胞中存在经典HLAⅠ类等位基因选择性得异常表达，且抑制NK细胞活性的HLA等位基因选择性高表达，可能是肝癌细胞在NK细胞与CTL双重免疫压力下的免疫逃逸机制之一。
　　经典HLAⅠ类等位基因特异性定量PCR引物的设计为同一HLA基因座位不同等位基因mRNA表达的定量定性分析提供了方法，在HLA表达相关的病毒免疫、肿瘤免疫、自身免疫等领域研究中具有重要应用价值;HLA基因具有高度多态性，本研究为深入探讨肝癌细胞免疫逃逸机制奠定了实验基础，还需扩大样本量对实验结果进一步验证。

目录

声明

摘要

主要英文缩写词

前言

第一章 文献综述 NK细胞在肝脏疾病中的作用研究进展

引言

一、NK细胞

1．NK细胞亚群

2．NK细胞活化

二、肝脏NK细胞

三、NK细胞在肝脏疾病中的作用

1．HBV感染

2．HCV感染

3．肝纤维化

4．自身免疫性肝病

5．肝细胞性肝癌

第二章 肝癌患者KIR基因和HLA-A、-B、-C基因高分辨分型

引言

第一节 肝癌患者KIR基因分型

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二节 肝癌患者HLA-A、-B、-C基因高分辨分型

一、材料

二、方法

二、结葡果术

四、讨论

第三章 经典HLAI类等位基因特异性定量PCR引物的设计与验证

引言

一、材料

1．研究对象

2．主要仪器软件及数据库

3．主要试剂

4．主要溶液配制

二、方法

1．肝脏组织RNA提取

2．RNA逆转录

3．引物设计

三、结果

1．构建经典HLAI类等位基因位点特异性碱基数据库

2．引物设计-寻找特异性碱基位点

3．引物验证

4．引物应用范围

四、讨论

第四章 HLA、KIR基因型与肝癌细胞中经典HLAI类等位基因mRNA选择性表达的相关性研究

引言

一、研究对象与方法

1．研究对象、实验仪器、试剂

2．内参引物选择

3．定量引物

4．定量PCR反应体系及条件

5．定量PCR数据处理

6．统计方法

二、结果及统计分析

1．经典HLAI类等位基因mRNA表达变化

2．定量PCR结果统计分析

三、讨论

小结

致谢

参考文献

作者简介