一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法

摘要

本发明提供了一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法。所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子和位于其下游的shRNA序列，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV-eGFP-LoxP。应用本发明获得的RNA干扰作用具有肝癌组织特异性高、作用长效、高效、指示良好、操作简便等特点。本发明使肝癌RNA干扰靶向治疗成为可能，并极大地方便了相关研究分析，可广泛应用于肝癌治疗及基础研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种肝癌组织特异性RNA干扰系统及其建立和应用方法。

背景技术

原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性疾病。其发病率虽只列恶性肿瘤发病率的第六位，但是死亡率却高居第三位。中国是原发性肝癌高发国，发病人数约占全球的55％。全国第三次死因回顾抽样调查报告显示：肝癌是我国恶性肿瘤相关死亡的第二位死因(在城市和男性则是首位死因)。肝癌在诊断时多已晚期，其治疗方法有限，如何有效治疗肝癌是我国目前亟需解决的重大问题。

近年来，RNA干扰成为一种潜在的癌治疗方法。RNA干扰是一种特异性的基因沉默方法。自发现以来已经迅速发展成为基因研究的有力工具并成为一种具有极大潜在价值的治疗方法。迄今为止已有的研究已证实其在疾病治疗方面的有效性和可行性。肝癌是一种基因功能改变引起的疾病。近年来，系统生物学水平的研究取得前所未有的巨大进展，确立了诸多重要的致癌基因，这些癌相关基因的发现为肝癌治疗提供了前所未有的巨大机遇。此外，因为RNA干扰物质易于给入肝脏，肝肿瘤适合进行RNA干扰治疗(肝肿瘤动物模型已作为一个优良的研究模型广泛用于RNA干扰治疗的研究)。因此，RNA干扰治疗在肝癌治疗方面具有巨大的潜能。可以预见的是在不远的将来RNA干扰治疗一定会广泛应用于肝癌治疗。

但是，尽管RNA干扰作为一种治疗方法具有巨大潜力，要使其成为一种有效的治疗方法必须解决几个问题。这些问题包括RNA干扰的特异性，RNA干扰作用的持续性，RNA作用的效能等。RNA干扰表达必须局限于肝癌细胞内，非肝癌细胞(如正常肝细胞)应免于RNA干扰作用已避免和消除RNA干扰的副作用。这对于肝癌患者特别重要，因为肝癌患者多伴有肝硬化，剩余的正常功能肝细胞减少，肝功能储备有限。目前最常用的RNA干扰药物是化学合成的小RNA(siRNA)和基于质粒的III型启动子(Pol III启动子，如U6或H1)驱动的shRNA。siRNA和III型启动子驱动shRNA没有组织特异性，会沉默任何类型细胞的靶基因，因而可能会在RNA干扰治疗作用时不仅作用靶细胞，同时作用于非靶细胞。此外，siRNA或III型启动子驱动shRNA的作用时间短(很少超过一周或几周，而癌治疗作用必须能够维持至少更长的时间)；同时两者的转染效率低，细胞的摄入有限，这些是目前RNA干扰治疗应用的重要挑战。为了获得组织特异性、长期和高效的RNA干扰，一个可能的解决方案是应用组织特异性启动子(限制治疗性RNA干扰表达于靶细胞)结合慢病毒载体(借助慢病毒载体特性获得高转染效能和稳定长效的RNA干扰作用)来实现。AFP启动子是肝癌细胞的组织特异性启动子，高度特异于肝癌细胞，可以实现肝癌组织特异性表达。但是AFP启动子是II型启动子(Pol II)，虽可驱动基因过表达，但却不能直接驱动干扰物质shRNA的表达，本发明创造性地应用Cre/LoxP开关系统结合AFP启动，采用一种创新的设计，实现了AFP驱动shRNA表达。慢病毒载体是一种能够获得长期、高效体内外RNA干扰作用的强大工具，目前已被广泛应用于基础研究和转化医学研究。慢病毒干扰载体可以高效感染靶细胞(＞99％)将RNA干扰结构(如shRNA)整合入靶细胞的基因组，实现稳定表达，产生长效的RNA干扰基因沉默。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌组织特异性的RNA干扰系统及其建立和应用方法，该系统可以肝癌组织特异性地、高效地、长效地沉默靶基因，从而为RNA干扰治疗提供了一种有效的治疗工具，使肝癌RNA干扰治疗成为可能，为RNA干扰治疗应用于肝癌治疗铺平道路。

为了达到上述目的，本发明提供了一种肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)，其特征在于，由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成(图1(A))，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因(称为AFP-Cre结构)，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位于其下游的shRNA序列(称为LoxP-shRNA结构)，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)为在U6启动子中插入一个可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构的U6启动子，所述的可指示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是否工作的结构为LoxP-CMV-eGFP-LoxP。

优选地，所述的shRNA序列为针对靶基因的shRNA序列。

本发明的肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)能够特异性地工作于肝癌组织细胞，特异性地在肝癌组织细胞中发挥RNA干扰作用，而对于非肝癌组织细胞则无作用。其工作原理如下：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染肝癌细胞组织，感染后AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体凭借其慢病毒特性将AFP-Cre结构和LoxP-shRNA结构整合入宿主细胞基因组并使其在宿主细胞内稳定表达。AFP-Cre中的AFP启动子驱动其下游的Cre重组酶基因表达产生Cre重组酶，Cre重组酶剪切LoxP-shRNA中的U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6启动子中的LoxP-CMV-eGFP-LoxP结构，恢复U6启动子正常结构，激活U6启动子活性，活化的U6启动子驱动其下游shRNA表达，shRNA表达后沉默靶基因。本发明所述的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统含有指示结构(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)，具有自动指示功能，可依靠GFP荧光之减弱有无指示系统是否工作。若AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染靶细胞后GFP荧光减弱/消失则表明系统已工作，反之则系统未工作。其原理如下：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染靶细胞后，系统中的LoxP-shRNA载体立即表达(LoxP-shRNA载体无特异性，在任何组织细胞中均可表达)，其含有的指示结构(LoxP-CMV-eGFP-LoxP)中的CMV启动子驱动eGFP表达，使细胞组织产生GFP绿色荧光，荧光显微镜或活体成像可检测到GFP绿色荧光表达。若所感染的靶细胞为肝癌细胞，AFP-Cre/LoxP-shRNA系统所含的AFP-Cre会表达，AFP-Cre表达后，其AFP启动子驱动Cre表达，剪切LoxP-CMV-eGFP-LoxP结构，使得GFP不再表达，GFP荧光减弱至消失(图(1)B)(需说明的是：因AFP-Cre的AFP启动子活性弱于CMV-eGFP的CMV启动子，该过程表现为GFP荧光减弱至消失，而非GFP不表达)；若为非肝癌细胞，则AFP-Cre不能表达，GFP荧光不减弱(图(1)C)。

本发明还提供了上述的肝癌组织特异性RNA干扰系统的建立方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：构建AFP-Cre载体：

步骤1.1：取pDRIVE-SV40-hAFP之AFP启动子序列，根据其序列改造设计并人工合成新的AFP启动子片段(540bp)(具体序列见说明书末尾)，以NheI和EcoRI限制性内切酶酶切pUC57质粒，T4连接酶连接，将AFP启动子片段克隆入pUC57质粒，形成含有AFP启动子片段的重组质粒pUC57-AFP，转化感受态细胞DH5α，扩增，抽提质粒；

步骤1.2：以pUC57-AFP为模板，以Gecp-1，2为引物(引物序列见表1)，常规PCR扩增获得AFP启动子片段；以pCAG-Cre为模板，以Gecp-3，4(表1)为引物，常规PCR扩增获得Cre片段(1070bp)；然后以AFP启动子片段和Cre片段为模板，以Gecp-1，4为引物(表1)，行PCR拼接获得全长目的基因片段(AFP-Cre)；

步骤1.3：用Spe I和Xba I限制性内切酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切，酶切产物电泳后回收7.0kb的载体片段(pCDH-CMV-MCS-EF 1-Puro酶切片段)；

步骤1.4：将目的基因片段AFP-Cre以同源重组法与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段重组，构建成AFP-Cre重组质粒；

步骤1.5：转化感受态细胞DH5α，挑取转化子行菌落PCR鉴定阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒；

步骤1.6：表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞铺板，将AFP-Cre重组质粒与包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl₂溶液混合后加入培养皿中常规培养；转染24小时后收取上清病毒液，高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；最终形成的AFP-Cre慢病毒颗粒即为AFP-Cre载体；

步骤2：构建LoxP-shRNA载体：

步骤2.1：以pSil02质粒为模板，以Gecp-5和Gecp-6为引物(表1)，采用常规PCR扩增获得片段A；以pSil02质粒为模板，以Gecp-7和Gecp-8为引物(表1)，采用常规PCR扩增获得片段B；以pSil04质粒为模板，以Gecp-9，Gecp-10，Gecp-11和Gecp-12为引物(表1)，采用常规PCR扩增获得片段C；以Gecp-5和Gecp-8为引物(表1)，以片段A、B、C为模板，行PCR获得片段D，即为U6-LoxP-CMV-eGFP-U6结构片段；

步骤2.2：以XhoI和EcoRI限制性内切酶分别酶切片段D和pSil02质粒，T4连接酶连接，将片段D克隆入pSil02质粒形成LoxP-shRNA重组质粒；

步骤2.3：转化感受态细胞，扩增，测序鉴定阳性克隆，接种阳性克隆后扩增，进行质粒抽提；

步骤2.4：表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞铺板，将LoxP-shRNA重组质粒与无内毒素包装质粒psPAX2和pMD2.G和CaCl₂溶液混合后加入培养皿中常规培养；转染24小时后收取上清病毒液，高速离心浓缩病毒后以PCR法检测病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度；；最终形成的LoxP-shRNA慢病毒颗粒即为LoxP-shRNA载体；

步骤3：形成肝癌组织特异性RNA干扰系统：将AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体以1-5∶1比例混合溶于Opti-MEM液中，形成肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)。

优选地，所述的步骤2.2还包括将LoxP-shRNA重组质粒以AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切回收载体片段，取可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4连接酶连接，将针对靶基因的shRNA克隆入LoxP-shRNA质粒，形成针对靶基因的LoxP-shRNA重组质粒；所得的针对靶基因的LoxP-shRNA重组质粒继续进行后续步骤。

本发明还提供了上述肝癌组织特异性RNA干扰系统的体外应用方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：构建针对靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统：取LoxP-shRNA质粒，以AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切回收载体片段，取验证有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4连接酶连接，将shRNA克隆入LoxP-shRNA质粒，形成针对靶基因的LoxP-shRNA重组质粒，转化，鉴定、测序无误后接种抽提质粒，再慢病毒包装，形成LoxP-shRNA载体，将LoxP-shRNA载体与AFP-Cre载体按照1-5∶1混合形成针对靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统；

步骤2：使用AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染细胞：常规培养细胞(通常为混合培养细胞)，根据待作用的靶细胞之细胞量，取感染复数为10-20(MOI＝10-20)，计算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系统的量，将AFP-Cre/LoxP-shRNA系统加入细胞培养液内，同时加入polybrene至终浓度2ug/ml，混匀后作用于对象细胞，感染24h后换液；

步骤3：检测：①GFP指示检测：荧光显微镜下观察GFP有无减弱和消失，若GFP荧光减弱/消失，表明肝癌组织特异性RNA干扰系统工作；②靶基因mRNA和蛋白检测：以定量PCR(Q-PCR)和western blot检测靶基因mRNA和蛋白表达抑制与否。

本发明还提供了上述肝癌组织特异性RNA干扰系统的体内应用方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：构建针对靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统：取LoxP-shRNA质粒，以AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切回收载体片段，取验证有效的可有效抑制靶基因的shRNA片段退火，T4连接酶连接，将shRNA克隆入LoxP-shRNA质粒，形成针对靶基因的LoxP-shRNA重组质粒，转化，鉴定、测序无误后接种抽提质粒，再慢病毒包装，形成LoxP-shRNA载体，将LoxP-shRNA载体与AFP-Cre载体按照1-5∶1混合形成针对靶基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统；步骤2：根据瘤体估算细胞量，根据细胞量，取感染复数为10-20(MOI＝10-20)，计算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA系统的量；以1ml胰岛素注射器瘤内注射或者静脉注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系统；

步骤3：检测：①GFP指示检测：使用带有荧光探头的活体动物成像仪，检测肿瘤细胞组织荧光显色，根据肿瘤细胞荧光显色有无减弱，判断是否工作；②靶基因mRNA和蛋白检测：体内实验完毕后，切取肿瘤，以定量PCR(Q-PCR)和western blot检测靶基因mRNA和蛋白表达抑制与否。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明创造性地实现了肝癌组织特异性RNA干扰，首次实现了肝癌组织特异性靶基因沉默，为RNA干扰治疗肝癌提供了有力工具，由于RNA作用具备肝癌组织特异性，对肝癌周围组织细胞无作用，理论上预期可以避免RNA干扰治疗所致的副作用。本发明克服了现有技术的组织特异性缺陷，是现有技术所不具备的。因为实现了肝癌组织特异性RNA干扰，本发明所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)对于肝癌的临床治疗和基础研究具有显著的效果：在临床治疗方面，它使得靶向干扰治疗肝癌成为可能。在基础研究方面，其大大拓展了基础研究范围，使许多之前不能实现的研究成为可能；

(2)本发明较之现有技术，实现了其无法实现的高效与长效。本发明因采用慢病毒作为基础载体，凭借慢病毒的强大感染能力和逆转录能力等，克服了目前现有技术所用的siRNA的细胞导入效率低和作用时间短等不足，实现了高效感染导入，长期作用，具有转染效率高、表达稳定高效、作用时间长，操作简便，细胞毒性小等优点；

(3)本发明较之现有技术，具备其所不具备的指示功能。本发明所述系统带有指示结构，由于具有良好的GFP指示功能，为实际应用观察提供了极大的便利，体外可借助荧光显微镜，体外可借助活体成像，观察非常方便；

本发明的应用价值：本发明可广泛应用于肝癌靶向治疗的临床应用和基础研究，具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。包括：(1)肝癌的靶向治疗临床应用：对于研究已明确在肝癌中起重要作用、临床价值确切之癌基因，应用本系统肝癌组织特异性地靶向抑制其表达治疗肝癌；(2)肝癌的靶向治疗研究：肝癌动物模型研究中，应用本发明体内特异性地干扰靶基因，确认靶基因是否具有治疗作用，探讨其临床价值；(3)基础研究：例如用于肿瘤微环境在肝癌发生发展中的作用的相关研究，体外肝癌细胞和间质细胞共培养是研究肿瘤微环境的重要手段，应用现有技术，加入无组织特异性干扰物后会同时攻击非肝癌细胞，应用本发明可特异性干扰其中的肝癌细胞而不会干扰间质细胞的靶基因，得到确切可靠的研究结果；(4)本发明中采用的Cre/LoxP-shRNA结构可改造通用于其他组织特异性启动子驱动实现其他组织特异性RNA干扰。例如利用前列腺癌PSA启动子替代AFP启动子，改造后可以实现前列腺癌组织特异性RNA干扰。

附图说明

图(1)为肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)的结构和工作示意图：(A)AFP-Cre和LoxP-shRNA载体图；(B，C)系统工作示意图：(B)系统在肝癌细胞组织中，AFP-Cre和LoxP-shRNA均表达，系统二工作，shRNA表达，RNA干扰起效；(C)系统在非肝癌细胞组织中，LoxP-shRNA表达而AFP-Cre不表达，系统不工作，shRNA不表达，无RNA干扰作用；

图(2)为体外实验验证AFP-Cre/LoxP-shRNA系统的有效性及组织特异性图：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染肝癌细胞(以HCCLM3肝癌细胞为例)和非肝癌细胞(以正常肝细胞L-02为例)，Q-PCR(左侧线图)和Westernblot检测(右侧条带图)结果显示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统可以组织特异性地干扰抑制肝癌细胞的靶基因(Beclin 1)的mRNA和蛋白表达，而对非肝癌细胞无作用(HCCLM3细胞受抑制，而L-02无抑制)；

图(3)为肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)的荧光指示功能检测图：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染肝癌细胞(以HCCLM3、HepG2和Hep3B肝癌细胞为例)和非肝癌细胞(以正常肝细胞L-02、宫颈癌细胞Hela和结肠癌细胞SW1116为例)，两周后荧光显微镜下拍照，系统在肝癌细胞内稳定工作，荧光减弱至消失，而在非肝癌细胞内不工作，荧光不减弱不消失；

图(4)为体内实验验证AFP-Cre/LoxP-shRNA系统的功能：(A)瘤内注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系统(以MHCC97L肝癌细胞皮下瘤为例)两周后，Q-PCR和Western blot检测表明靶基因(Beclin 1)mRNA和蛋白表达被有效干扰抑制；(B)荧光指示检测显示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统荧光指示功能良好，系统注入非肝癌细胞(宫颈癌Hela细胞)皮下瘤两周后活体动物成像GFP荧光不减弱，而系统注入肝癌细胞(MHCC97L)皮下瘤两周后荧光减弱至消失，指示系统工作起效；

图(5)应用本发明之AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5基因辅助治疗增强Sorafenib药效：(A)Q-PCR和Western blot检测表明应用AFP-Cre/LoxP-shRNA系统作用肝癌细胞组织后无论体外(上图)或体内(下图)均有效干扰抑制靶基因Atg5基因及蛋白表达(以MHCC97L为例，下同)；(B)应用AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制肝癌细胞Atg5基因可辅助增强Sorafenib诱导细胞凋亡作用；(C)皮下瘤成瘤实验：瘤内注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5基因可辅助增强Sorafenib抑制肿瘤成瘤作用。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

本实施例用以说明肝癌组织特异性RNA干扰系统AFP-Cre/LoxP-shRNA的构建过程，以及应用该系统特异性抑制靶基因(Beclin 1)；

一种肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)由AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体组成(如图1(A)所示)，AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体均由慢病毒载体构建而成，其中，AFP-Cre载体含有一个AFP启动子和位于其下游的Cre重组酶基因(称为AFP-Cre结构)，LoxP-shRNA载体含有一个经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)和位于其下游的针对靶基因的shRNA序列(称为LoxP-shRNA结构)，LoxP-shRNA载体中所含的经过改造的U6启动子(U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6)为在U6启动子157bp处插入一个LoxP-CMV-eGFP-LoxP结构的U6启动子。

(一)肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)的构建过程：

(1)AFP-Cre载体构建：使用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro作为母载体构建，将AFP启动子和CRE重组酶基因接在一起，替换pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上的CMV启动子，具体步骤为：

①取pDRIVE-SV40-hAFP(购自InvivoGen公司)之AFP启动子序列，根据其序列改造设计并人工合成新的AFP启动子片段(540bp)(具体序列见说明书末尾)。以NheI和EcoRI限制性内切酶(购自Genescript公司)酶切pUC57质粒(购自Genescript公司)，T4连接酶(购自Genescript公司)连接，将AFP启动子片段克隆入pUC57质粒，形成含有AFP启动子片段的重组质粒pUC57-AFP，转化感受态细胞DH5α(购自闪晶公司)，扩增，抽提质粒(Qiagen质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司)(相关操作参照《分子克隆实验指南(第3版)》及各产品说明书进行，以下同)；

②以pUC57-AFP重组质粒为模板，以Gecp-1，2为引物(引物序列见表1)，进行PCR法扩增AFP启动子片段(PCR反应体系见附1，下同)；以pCAG-Cre质粒(购自Addgene)为模板，以Gecp-3，4(表1)为引物，以PCR法扩增获得1070bp的Cre片段；然后以AFP启动子片段和Cre片段为模板，以Gecp-1，4为引物，PCR法拼接获得全长目的基因片段(AFP-Cre)(1605bp)；

③用Spe I和Xba I限制性内切酶(购自Genescript公司)对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒(购自SBI公司)进行酶切，酶切产物电泳后回收7.0kb的载体片段(pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段)；

④将目的基因片段AFP-Cre以同源重组法(Clontech公司，同源重组反应体系见附2)与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro酶切片段重组，构建成AFP-Cre重组质粒(图1A)；

⑤转化感受态细胞DH5α(购自闪晶公司)，挑取转化子行菌落PCR鉴定(菌落PCR反应体系见附3)阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序(Invitrogen公司)。测序没有问题的，再接种抽提质粒。；

⑥表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞(购自中国科学院细胞库)铺板，细胞密度为3×10⁶细胞/皿。将AFP-Cre重组质粒与无内毒素包装质粒psPAX2和pMD2.G(购自Trono Lab)及CaCl₂溶液混合后逐滴加入等体积的2×HBS中，加入混合溶液轻轻加入培养皿中并混匀后常规培养(具体操作参照Trono Lab慢病毒包装说明进行)。转染约8小时后用完全培养基进行换液；换液后24小时，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2％FBS的低血清培养基，24h后第二次收取上清病毒液后，丢掉细胞。振荡混匀后4℃以10,000g高速离心30min，吸干上清后加入适量OMEM溶解沉淀。浓缩病毒后以PCR法检测每基因组整合的病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度，病毒冻存于-80度冰箱备用。

⑦最终形成的AFP-Cre慢病毒颗粒即为AFP-Cre载体。

(2)LoxP-shRNA载体构建：

①以pSil02质粒(购自MicroSCI公司)为模板，以Gecp-5，6为引物(表1)，进行PCR扩增获得片段A；以pSil02质粒为模板，以Gecp-7，8(表1)为引物，进行PCR扩增获得片段B；以pSil04质粒(购自MicroSCI公司)为模板，以Gecp-9，10，11，12(表1)为引物，进行PCR扩增获得片段C；

②以片段A、B、C为模板，以Gecp-5，8(表1)为引物，PCR扩增获得片段D(U6-LoxP-CMV-eGFP-U6)；

③以XhoI和EcoRI限制性内切酶(购自Genescript公司)酶切片段D和pSil02质粒，T4链接酶链接，将片段D克隆入pSil02质粒形成LoxP-shRNA重组质粒(图1(A))；

④转化感受态细胞DH5α(购自闪晶公司)，挑取转化子行菌落PCR鉴定(菌落PCR反应体系见附3)阳性克隆，接种阳性克隆，保种并分装送测序(Invitrogen公司)。测序没有问题的，再接种抽提质粒；

⑤表达载体(慢病毒)包装、浓缩及滴度测定：选择生长旺盛期293T细胞(购自中国科学院细胞库)铺板，细胞密度为3×10⁶细胞/皿。将LoxP-shRNA重组质粒与无内毒素包装质粒psPAX2和pMD2.G(购自Trono Lab)及CaCl₂溶液混合后逐滴加入等体积的2×HBS中，加入混合溶液轻轻加入培养皿中并混匀后常规培养(具体操作参照Trono Lab慢病毒包装说明进行)。转染约8小时后用完全培养基进行换液；换液后24小时，在生物安全柜中收取上清病毒液，并加入含2％FBS的低血清培养基，24h后第二次收取上清病毒液后，丢掉细胞。振荡混匀后4℃以10,000g高速离心30min，吸干上清后加入适量OMEM溶解沉淀。浓缩病毒后以PCR法检测每基因组整合的病毒拷贝数，于293T细胞测定滴度，病毒冻存于-80度冰箱备用；

⑥最终形成的LoxP-shRNA慢病毒颗粒即为LoxP-shRNA载体；

(3)形成AFP-Cre/LoxP-shRNA系统：将AFP-Cre载体和LoxP-shRNA载体以1∶1比例混合溶于Opti-MEM液(购自Invitrogen公司)中，形成肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)。

附1：PCR反应体系(Takara试剂盒，购自宝生物公司)：

PCR循环条件：

附2：同源重组反应体系(购自Clontech公司)：

于37℃孵育15min，再50℃孵育15min，立刻转化或冻存于-20℃以后转化。

附3：菌落PCR反应体系(Takara试剂盒，购自宝生物公司)：

PCR循环条件：

(二)应用AFP-Cre/LoxP-shRNA系统组织特异性抑制靶基因(Beclin 1)：

①构建靶向Beclin1基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统：取LoxP-shRNA质粒，以AgeI和EcoRI限制性内切酶(购自Genescript公司)酶切回收载体片段。取验证有效的可有效抑制靶基因Beclin1的shRNA及其阴性对照(NC)片段(Invitrogen公司合成，序列见表2)退火，T4连接酶连接，将shRNA克隆入LoxP-shRNA质粒，形成针对靶基因Beclin1的LoxP-shRNA重组质粒(LoxP-shRNA-Beclin1和LoxP-shRNA-NC)，转化，鉴定、测序无误后接种抽提质粒，将LoxP-shRNA-Beclin1和LoxP-shRNA-NC进行慢病毒包装(操作同实施例1)，形成LoxP-shRNA-Beclin1载体和LoxP-shRNA-NC载体。将LoxP-shRNA-Beclin1或LoxP-shRNA-NC载体与AFP-Cre按照1∶1混合形成靶向Beclin1的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA-Beclin1)及其阴性对照(AFP-Cre/LoxP-shRNA-NC)；

②AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染细胞：取AFP阳性肝癌细胞(HCCLM3细胞，购自复旦大学肝癌研究所，HepG2/Hep3B细胞，购自中国科学院细胞库)及非肝癌细胞(正常肝细胞L-02、宫颈癌细胞Hela、结肠癌细胞SW1116，购自中国科学院细胞库)以24板均匀铺板，培养至30％融合，感染复数分别取1，5，10，20，每个感染复数设三个复孔，根据待作用的靶细胞之细胞量，计算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA量，将AFP-Cre/LoxP-shRNA系统加入培养液内(DMEM培养液，购自Gibco公司)，同时加入polybrene(购自Sigma公司)至终浓度2ug/ml，混匀后作用于对象细胞，感染24h后换液。AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染后荧光显微镜持续观察拍照，持续培养扩增；

③确定系统有效性、组织特异性以及最佳感染复数(MOI)：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统作用后的细胞扩增，进行Q-PCR和Western blot分析干扰沉默效率，同时以MTT法检测细胞活力及增殖力(Beclin1抗体购自CST，其他试剂购自Qiagen和Sigma，操作参照《细胞实验指南》及产品说明书进行，下同)。Q-PCR和Western blot检测结果显示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统可有效干扰抑制靶基因mRNA和蛋白表达，且该作用为肝癌组织特异性(对肝癌细胞中可有效干扰抑制，而对于非肝癌细胞无干扰抑制作用)(图(2))。按照RNA干扰沉默率＞75％、感染率和表达率＞95％、荧光指示良好，以及细胞活力及增殖力良好，取符合以上要求之最小感染复数，确定MOI＝20为最佳感染感染复数；

④荧光指示功能检测：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统作用后，持续荧光显微镜观察。结果表明，系统感染肝癌细胞(HCCLM3、HepG2、Hep3B)后，荧光表达逐渐减弱至消失，而非肝癌细胞则荧光不减弱，GFP荧光指示结构可良好指示系统是否工作(图(3))。

⑤体内应用有效性检测：36只小鼠随机分为6组(每组6只)，1×10⁷MHCC97L细胞(购自复旦大学肝癌研究所)右肩胛区皮下注射，建立皮下瘤，当皮下瘤最大直径长至4mm时，以BD 1ml胰岛素注射器瘤内注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系统及其对照(小鼠分组及每组瘤内注射如下：Blank组：(50μl Opti-MEM)，Cre+LoxP NC组：AFP-Cre/LoxP-shRNA-NC系统(0.5×10⁸TU AFP-Cre+0.5×10⁸TU LoxP-shRNA-NC)置于50μl Opti-MEM；AFP-Cre组：1×10⁸TU AFP-Cre载体置于50μl Opti-MEM；LoxP-shRNA组：1×10⁸TULoxP-shRNA  载体置于50μl Opti-MEM；Cre+LoxP 组1：AFP-Cre/LoxP-shRNA-Beclin1系统(0.25×10⁸TU AFP-Cre+0.25×10⁸TULoxP-shRNA-Beclin1)置于50μl Opti-MEM；Cre+LoxP 组2：AFP-Cre/LoxP-shRNA-Beclin1系统(0.5×10⁸TU AFP-Cre+0.5×10⁸TULoxP-shRNA-Beclin1)置于50μl Opti-MEM)，所有小鼠在两周后处死，处死后立即切取肿瘤组织，行Q-PCR和Western blot分析检测体内干扰沉默效率。Q-PCR和Western blot检测结果表明瘤内注射系统可以有效抑制肝癌组织的靶基因Beclin1的mRNA和蛋白表达(图(4)A)。

⑥体内荧光指示功能检测：12只小鼠随机分为2组(每组6只)：肝癌细胞组和非肝癌细胞组。两组的小鼠分别行右肩胛区皮下注射(1×10⁷MHCC97L肝癌细胞(购自复旦大学肝癌研究所)或Hela宫颈癌细胞(购自中科院细胞库))，建立肝癌及非肝癌细胞皮下瘤，当皮下瘤最大直径长至4mm时，以1ml胰岛素注射器(购自BD公司)瘤内注射AFP-Cre/LoxP-shRNA-Beclin1系统(0.5×10⁸TUAFP-Cre+0.5×10⁸TU LoxP-shRNA-Beclin1置于50μl Opti-MEM)，系统瘤内注射后使用带有荧光探头的小动物活体成像仪(购自Kodak公司)隔日行小动物活体成像，检测结果显示，肝癌细胞MHCC97L皮下瘤GFP荧光逐渐减弱至消失，非肝癌细胞Hela皮下瘤GFP荧光不减弱(图(4)B)，GFP可于体内良好指示系统工作与否。

实施例2

实施例2用以进一步说明本发明的具体应用。应用本发明所述的肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)抑制Atg5基因增强Sorafenib疗效。

有研究显示抑制Atg5基因可以增强sorafenib药效，应用siRNA体外实验验证表明抑制Atg5可显著增强sorafenib诱导肝癌细胞凋亡作用，Atg5因而成为一个潜在的治疗靶基因。但因为缺乏肝癌组织特异性RNA干扰系统，无法于体内外组织特异性干扰Atg5基因而无法实现靶向治疗。本发明应用本发明所述AFP-Cre/LoxP-shRNA系统组织特异性抑制Atg5，体外及体内应用观察其疗效。

①构建靶向Atg5基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统：取LoxP-shRNA质粒，以AgeI和EcoRI限制性内切酶酶切回收载体片段。取验证有效的可有效抑制靶基因Atg5的shRNA及其阴性对照(NC)片段(序列见表2)退火，T4连接酶连接，将shRNA克隆入LoxP-shRNA质粒，形成针对靶基因Atg5的LoxP-shRNA重组质粒(LoxP-shRNA-Atg5)及其阴性对照(LoxP-shRNA-NC)，转化，鉴定测序无误后接种抽提质粒，将LoxP-shRNA-Atg5和LoxP-shRNA-NC进行慢病毒包装(包装同实施例1)，形成LoxP-shRNA-Atg5载体和LoxP-shRNA-NC载体。将LoxP-shRNA-Atg5或LoxP-shRNA-NC载体与AFP-Cre按照1∶1混合形成针对Atg5基因的AFP-Cre/LoxP-shRNA系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA-Atg5)及其阴性对照(AFP-Cre/LoxP-shRNA-NC)；

②AFP-Cre/LoxP-shRNA系统感染细胞：肝癌细胞(MHCC97L和HepG2)以24板均匀铺板，培养至30％融合，感染复数分别取1，5，10，20，每个感染复数设三个复孔，根据待作用的靶细胞之细胞量，计算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA量，将AFP-Cre/LoxP-shRNA系统加入培养液内(DMEM培养液，购自Gibco公司)，同时加入polybrene(购自Sigma公司)至终浓度2ug/ml，混匀后作用于对象细胞，感染24h后换液，荧光显微镜持续观察拍照，持续培养扩增；

③确定系统抑制Atg5的有效性、组织特异性以及最佳感染复数(MOI)：AFP-Cre/LoxP-shRNA系统作用后的细胞扩增，行Q-PCR和Western blot分析干扰沉默效率，同时以MTT法检测细胞活力及增殖力(操作同实施例1)。Q-PCR和Western blot检测结果显示AFP-Cre/LoxP-shRNA-Atg5无论体外(图(5)A上图)或体内(图(5)A下图)应用均可有效干扰抑制Atg5基因mRNA和蛋白表达。按照RNA干扰沉默率＞75％、感染率和表达率＞95％、荧光指示良好，以及细胞活力及增殖力良好，取符合以上要求之最小感染复数，确定MOI＝20为最佳感染感染复数(图(5)A)；

④AFP-Cre/LoxP-shRNA系统干扰抑制Atg5增强sorafenib作用体外检测：肝癌细胞MHCC97-L(购自复旦大学肝癌研究所)，以24板均匀铺板，培养至30％融合，感染复数取20，计算所需AFP-Cre/LoxP-shRNA量，然后加入AFP-Cre/LoxP-shRNA-Atg5系统(病毒液)，感染一周后AFP-Cre/LoxP-shRNA-Atg5作用后的细胞予以20μM sorafenib(Bayer公司)作用24h，以AFP-Cre，LoxP-shRNA，或AFP-Cre/LoxP-shRNA-NC作用的细胞为对照，细胞行Annexin V/PI流式细胞检测(BD公司)。结果显示AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5后，sorafenib诱导MHCC97-L和PLC/PRF/5细胞的凋亡率显著增加(图(5)B)，表明应用AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5后可增强sorafenib诱导凋亡作用；

⑤AFP-Cre/LoxP-shRNA系统干扰抑制Atg5增强sorafenib作用体内应用检测：12只小鼠随机分为2组(每组6只)，建立肝癌皮下瘤(1×10⁷MHCC97L细胞于右肩胛区皮下注射)，当皮下瘤最大直径长至4mm时，以BD 1ml胰岛素注射器瘤内注射如下：Sorafenib组：50μl Opti-MEM；Sorafenib+Cre/LoxP组：AFP-Cre/LoxP-shRNA-Atg5(0.5×10⁸TU AFP-Cre+0.5×10⁸TULoxP-shRNA-Atg5)置于50μl Opti-MEM。瘤内注射系统后一周，小鼠予以每日腹腔内注射sorafenib(30mg/kg/d)，小鼠在肿瘤细胞种植后6周后处死，处死后切取肿瘤组织，以电子秤称重肿瘤，比较两组皮下瘤重量，结果显示瘤内注射AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5基因可增强Sorafenib抑制肿瘤成瘤作用(图(5)C)。体外及体内检测表明AFP-Cre/LoxP-shRNA系统抑制Atg5可以增强sorafenib疗效，AFP-Cre/LoxP-shRNA系统是有效的肝癌组织特异性RNA干扰系统。

AFP启动子片段序列：

ACCGGTGAATTCGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCTGAAAGAAC

CAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA

GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAA

AGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCACTGCAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAAT

AAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCG

CTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACA

AAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCT

TCCACCACTGCCAATAACACGCTAGCGCGGCCGC

说明：下划线为AFP启动子序列，加粗序列为NheI和EcoRI限制性内切酶酶切位点。

AFP-Cre结构序列：

ACTAGTGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCTGAAAGAACCAGCTG

TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCA

TCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC

ATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCACTGCAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAA

GTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTG

TTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTA

CTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACT

GCCAATAACACGCCACC

注释：(1)加粗：ACTAGT和TCTAGA是SpeI和XbaI限制性酶切位点；(2)

实下划线：AFP启动子；(3)虚下划线：Cre重组酶基因。

U6-LoxP-CMV-eGFP-LoxP-U6结构序列：

GGGCTCGAGCCCGGGAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATAC

GATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATAC

GTGACGTAGAAAGTAATGTTAACGTGGATAACCGTAT

TACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCC

GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATA

ATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTA

AACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTA

AATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTA

TTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTC

ACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACT

TTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTA

TATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACC

GGATCCTTTTAAAATG GACTATCAT

ATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGG

TCCGCAGGTATGCACGCGTGAATTC

注释：(1)实下划线：CMV启动子；(2)虚下划线：eGFP基因；(3)

LoxP

表1.构建肝癌组织特异性RNA干扰系统(AFP-Cre/LoxP-shRNA系统)所用

引物序列

表2.针对Beclin1和Atg5基因的shRNA序列及shRNA阴性对照(NC)序列