曲妥珠单抗-纳米金探针制备及对乳腺癌细胞体外生长抑制作用

摘要

目的:构建新型曲妥珠单抗-纳米金生物探针，研究其对乳腺癌细胞的作用，探寻乳腺癌纳米靶向治疗新方法。
　　方法:采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备不同尺寸(10nm、20 nm和40 nm)金纳米粒子（GNPs），并行透射电镜(TEM)表征，同时40 nm GNPs还进行紫外可见吸收光谱、水动力尺寸、zeta电位等检测。通过静电吸附原理将40 nm GNPs与曲妥珠单抗(Herceptin)偶联合成曲妥珠单抗-纳米金(Herceptin-GNPs)生物探针，表征方法同40 nmGNPs，并采用BCA蛋白定量法测Herceptin-GNPs中抗体偶联量。人乳腺癌细胞株BT474和MCF-7细胞表皮生长因子受体-2（HER2）表达情况采用免疫细胞化学法检测。采用扫面电子显微镜(SEM)观察BT474细胞膜表面的Herceptin-GNPs吸附作用。分别设置10 nm、20 nm和40 nm GNPs浓度为12.5～100μg/mL4个浓度，分别设置Herceptin-GNPs和Herceptin浓度为0.625～10μg/mL5个浓度，并设置对照组和空白组，作用于BT474和MCF-7细胞48 h，采用MTT法检测各组细胞增殖抑制情况。分别设置Herceptin-GNPs和Herceptin浓度为1.25、2.5、5μg/mL3个浓度，并设置对照组，采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染、PI单染法行流式细胞术检测BT474细胞凋亡率和周期变化情况，以及采用Western Blot技术分别检测p-AKT、p-MAPK、Bcl-2、HER2蛋白表达情况。
　　结果:(1)柠檬酸还原法制备的不同尺寸GNPs(10nm、20 nm和40 nm)水溶液呈酒红色，澄清透亮，TEM结果显示GNPs近似圆形，平均粒径大小分别为10.2±1.2 nm、20.9±2.0 nm和40.7±2.2 nm。通过紫外可见吸收光谱、水动力尺寸、zeta电位、TEM检测，证实成功合成Herceptin-GNPs探针，BCA法测得每毫升Herceptin-GNPs探针抗体偶联量为11.3μg，抗体偶联率约为37.67％，经计算得每个40 nm GNP表面可以连接约633个Herceptin分子。
　　(2)免疫细胞化学方法证明人乳腺癌MCF-7细胞HER2低表达，BT474细胞HER2高表达。在不同尺寸GNPs毒性研究方面，可见10 nm GNPs在50μg/mL可抑制BT474细胞增殖，而在100μg/mL时可抑制MCF-7细胞增殖，而20 nm和40 nm在100μg/mL及以下浓度时均未对两株细胞显示出明显增殖抑制作用，提示GNPs细胞毒性低。
　　(3)不同浓度Herceptin和Herceptin-GNPs对BT474细胞生长具有剂量依赖的抑制作用，Herceptin-GNPs较单独应用Herceptin抑制作用更强。流式细胞术检测显示Herceptin-GNPs和Herceptin均诱导BT474细胞凋亡，阻滞细胞于G0/G1期，且Herceptin-GNPs作用强于Herceptin。Western Blot结果显示，Herceptin-GNPs和Herceptin均可降低AKT、MAPK蛋白磷酸化水平，下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达，诱导细胞凋亡，降低HER2蛋白表达，且Herceptin-GNPs作用强于Herceptin。
　　结论:柠檬酸还原法制备的GNPs细胞毒性低，生物相容性好;Herceptin-GNPs较单独应用Herceptin能显著抑制HER2阳性乳腺癌BT474细胞增殖，抑制下游信号转导，诱导细胞凋亡，增加HER2内吞，在减少Herceptin用药剂量同时疗效增加，为HER2过表达乳腺癌的靶向治疗提供了新的方法。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表(Abbreviation)

前言

第一章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学分析方法

第二章 结果

3．1 GNPs和Herceptin-GNPs制备和表征

3．1．1 不同尺寸GNPs的TEM表征

3．1．2 盐沉淀法确定抗体偶联剂量

3．1．3 紫外-可见分光光度计检测40 nm GNPs和Herceptin．GNPs溶液紫外可见吸收峰和吸收曲线

3．1．4 DLS检测40 nm GNPs和Herceptin-GNPs水动力尺寸和zeta电位

3．1．5 Herceptin-GNPs TEM表征

3．1．6 BCA法测Herceptin-GNPs偶联抗体量

3．1．7 小结

3．2 乳腺癌BT474和MCF-7细胞HER2受体免疫细胞化学检测及GNPs细胞毒性研究

3．2．1 乳腺癌BT474和MCF-7细胞HER2受体表达鉴定

3．2．2 扫描电镜观察BT474细胞对Herceptin-GNPs的吸附作用

3．2．3 MTT法检测GNPs对BT474和MCF-7细胞活性影响

3．2．4 小结

3．3 Herceptin-GNPs和Herceptin对乳腺癌BT474细胞生长抑制作用

3．3．1 MTT法检测Herceptin-GNPs和HeKeptin对乳腺癌细胞生长抑制作用

3．3．2 Herceptin-GNPs和Herceptin对BT474细胞凋亡的影响

3．3．3 Herceptin-GNPs和HeKeptin对BT474细胞周期的影响

3．3．4 Western Blot检测相关蛋白表达

3．3．5 小结

第三章 讨论

结论

文献综述 纳米药物在乳腺癌治疗中的应用

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢

作者简介