长链非编码RNA TUC40-在胚胎心脏发育中作用的初步研究

摘要

目的:探索Pbx1/TUC40-在胚胎心脏发育中的作用。
　　方法:前期应用长链非编码RNA微阵列芯片筛查发现，在室间隔缺损人工流产的胚胎心脏组织中，超保守片段uc.40-异常高表达。采用链特异性逆转录实时定量聚合酶链反应确认uc.40-的转录本transcribed uc.40-(TUC40-)。应用生物信息学方法分析uc.40-，TUC40-及Pbx1的基本信息。进一步应用逆转录实时定量聚合酶链反应，分析Pbx1/TUC40-在小鼠胚胎发育过程中的表达谱;在P19细胞水平，采用质粒过表达uc.40-，通过检测心肌细胞标志物来判断过表达对分化的影响，应用流式细胞法（细胞周期）以及CCK8法检测细胞增殖，应用流式细胞法（细胞凋亡）以及caspase-3法检测细胞凋亡，应用实时定量聚合酶链反应检测Pbx1在细胞诱导过程中的变化趋势。
　　结果:我们应用链特异性逆转录实时定量聚合酶链反应确认了uc.40-的转录本——TUC40-。生物信息学分析显示TUC40-为反义长链非编码RNA，其正义基因Pbx1已被证实在室间隔胚胎发育中发挥重要作用。在小鼠胚胎发育过程中，Pbx1/TUC40-的表达具有时空特异性，在胚胎心脏发育中，它们的表达有反向趋势。在细胞模型中，uc.40-的过表达导致P19细胞分化障碍，阻碍P19细胞的增殖，使其易于发生凋亡，且导致Pbx1在诱导分化中丧失了上升趋势。
　　结论: uc.40-的过表达可能是导致胚胎心脏发育畸形的原因之一。uc.40-是否通过Pbx1发挥作用及其深入的致病机制有待进一步探讨。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

第一章 综述 心血管系统发育与疾病相关的长链非编码RNA的研究

第二章 材料与方法

1 研究对象

2 主要工具、试剂与耗材

2．1 生物信息学相关网站及软件

2．2 细胞培养相关试剂与耗材

2．3 细胞实验相关试剂与耗材

2．4 RNA实验相关试剂与耗材

2．5 Western blotting相关试剂与耗材

3 主要仪器设备

4 常用试剂配制

4．1 细胞实验相关试剂

4．2 RNA实验相关试剂

4．3 蛋白实验相关试剂

5 实验方法

5．1 生物信息学分析

5．2 表达谱构建

5．3 细胞水平实验

5．4 分子生物学实验

第三章 实验结果

1 生物信息学——uc．40-在不同水平的保守性分析

1．1 核苷酸序列水平

1．2 基因组位置水平

1．3 转录因子结合位点及相关转录因子的功能水平

2 动物实验——表达谱

2．1 TUC40-存在于胚胎心脏中

2．2 Uc．40-的表达量总体上低于Pbx1

2．3 Uc．40-的表达量具有时空特异性，Pbx1／TUC40-在心脏胚胎发育过程中呈现负相关

3 细胞实验

3．1 过表达验证

3．2 Uc．40-过表达导致Pbx1表达量减低

3．3 Uc．40-过表达阻碍了P19细胞向心肌样细胞分化

3．4 过表达使P19细胞发生细胞周期阻滞，进而阻碍了细胞增殖

3．5 过表达使P19细胞易于发生细胞凋亡

第四章 讨论

1 TUC40-存在，且不具有翻译成蛋白质的能力

2 Uc．40-在物种之间有突出的保守性，提示功能的保守性

3 Uc．40-的表达具有时空特异性

4 在胚胎心脏发育过程中Pbx1呈现上升趋势，uc．40-的表达量与其呈负相关

5 Uc．40-在P19细胞中过表达导致Pbx1失去上升趋势

6 Antisense lncRNA的作用方式及Pbx1／TUC40-相互作用方式的猜测

7 过表达导致心肌细胞分化能力减弱

8 过表达导致细胞周期阻滞，阻碍细胞增殖

9 过表达导致细胞易于发生饥饿诱导的凋亡

第五章 结论

第六章 问题与展望

参考文献

致谢

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