高氧诱导ROP模型SD大鼠中循环miRNAs检测分析及相关验证研究

摘要

目的：
　　本论文研究拟利用高通量测序手段系统全面的分析高氧诱导的ROP模型SD大鼠血浆样本以及视网膜组织中miRNA的差异表达情况，随后通过验证及其调控靶目标表达水平的检测分析，探索导致ROP产生的深层次的分子机制以及对ROP诊断治疗具有潜在价值的生物分子进行系统的评估。
　　方法与结果：
　　1)ROP模型SD大鼠的构建及其血浆循环miRNA的高通量测序筛选
　　首先选择新生SD大鼠进行高氧环境刺激，构建ROP模型，然后通过视网膜血管形态及增生情况进行模型动物构建成功与否的评价;随后收集模型组和对照组外周血液样本，分离血浆，制备模型组和对照组pool样本，提取RNA，质控后进行文库构建和Illumina HiSeq2500的高通量测序。实验结果显示:1）本研究中构建的ROP模型SD大鼠视网膜病变特征明显，显示视网膜血管发育滞缓，管径变细，分支减少而且有明显扩张迂曲，大量新生血管形成，血管密度增高，HE染色切片有很多的突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，ROP模型鼠构建成功;2）高通量miRNA测序结果显示在模型鼠与对照鼠血浆中存在一些具有显著性差异表达的miRNA，经过严格的筛选共获得上调的miRNA22种，下调的miRNA44种，所有后续深入研究涉及的miRNA将主要来源于此。
　　2)ROP模型鼠视网膜组织miRNA的高通量筛选
　　芯片检测结果显示ROP模型组与对照组之间存在一些差异表达的miRNA，进一步严格其筛选条件后获得了13种上调的miRNA和14种下调的miRNA，这些miRNA的靶基因功能富集显示其可能与对低氧的反应等相关的GO功能及调控通路有关，为进一步分析研究血浆中miRNA的差异表达情况提供了重要的参考。
　　3)循环miRNA差异表达情况的分析、验证与部分相关基因功能的研究
　　本部分研究结果如下:1）筛选出其中10种包含有高丰度表达、低丰度表达、高差异倍数、低差异倍数以及上调和下调的miRNA的表达情况都在定量PCR的验证结果中得到了证实，三种miRNA5p/3p的比值也在对应的分析中发现与测序结果一致;2）生物信息分析结果发现经过严格条件筛选的14种miRNA利用两种靶基因数据库预测能够获得594种共同的靶基因，对这些靶基因进行GO功能富集和KEGG分析发现，大多数都参与胚胎发育、细胞的形态变化、细胞移行、细胞的运动、细胞生物合成等且于血管新生密切相关的过程，同时还参与了细胞因子、神经营养因子、趋化因子以及MAPK和TGF-β的信号调节通路的正向调控，细胞间的细胞传递等;3）血浆VEGF和血浆GABA的水平分析发现，miRNA参与了这些关键的靶基因的表达调控，而且它们之间存在着相互协调、相互制衡的复杂关系，其中诸如miR-351、miR-200b等就共同靶向VEGF与GABA，提示这些miRNA可以作为潜在的ROP的治疗靶点进行进一步的深入研究和探索。
　　结论：
　　本论文研究利用高通量测序手段获得了一些差异表达的miRNA，部分miRNA在定量PCR中获得了证实;这些miRNA参与调控的与ROP密切相关的靶基因的表达情况也在论文中进行了研究与探讨;与视网膜组织相比较发现了一些共表达的miRNA，这些miRNA在几个典型的早产儿视网膜病变病例中得到了验证。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

绪论

第一部分 文献综述 早产儿视网膜病变研究进展

第二部分 高氧诱导ROP模型SD大鼠血浆循环miRNA表达谱的筛选

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 实验样本

2．2．3 研究方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 ROP模型大鼠的构建与表征

2．3．2 血清样本的RNA提取及质控结果

2．3．3 循环miRNA的高通量测序文库的构建与质控结果

2．3．4 循环miRNA的高通量测序的初步分析

2．4 小结

第三部分 高氧诱导ROP模型SD大鼠视网膜组织miRNA表达谱的检测分析

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 试验材料与主要仪器设备和试剂

3．2．2 试验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 RNA的提取与质控结果

3．3．2 差异表达miRNA的初步分析

3．3．3 靶基因预测

3．3．4 GO富集分析

3．3．5 Pathway分析

3．4 本章小结

第四部分 差异表达miRNA的验证及其靶基因的检测分析

4．1 前言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验材料及仪器设备与主要试剂

4．2．2 新生儿血液样本的收集及血浆RNA的提取

4．2．3 循环miRNA差异表达miRNA的定量PCR验证

4．2．4 差异表达miRNA靶基因的预测及功能富集分析

4．2．5 相关靶基因的表达验证与功能探索分析

4．2．6 循环miRNA与组织miRNA的差异表达分析及其在ROP新生儿样本中的验证

4．2．7 miR-351与VEGF，Ang-2的调控关系的研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 血浆循环miRNA差异表达情况的定量PCR验证分析

4．3．2 差异表达miRNA的靶基因预测及GO、KEGG分析

4．3．3 血管内皮生长因子与ROP模型鼠特异miRNA之的关系

4．3．4 γ-氨基丁酸与高氧诱导模型鼠特异的循环miRNA之间的关系

4．3．5 差异表达miRNA在ROP新生儿样本中的验证

4．3．6 猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞(RF／6A)中miR-351与VEGF，Ang-2的调控关系研究结果

4．4 本章讨论与小结

第五部分 总结展望

5．1 全文讨论总结

5．1．1 模型鼠构建的评价

5．1．2 差异表达miRNA的筛选

5．1．3 生物信息分析

5．1．4 个别miRNA与靶基因的验证与分析

5．1．5 视网膜组织差异表达miRNA的检测与分析

5．1．6 差异表达miRNA在早产儿病例中的初步验证

5．2 全文结论

5．3 存在的问题与研究展望

参考文献

致谢

作者简介