覆膜微针尖与原位细胞拉曼检测系统的研制

摘要

在生命科学研究中，获得细胞生理过程中详细和准确的信息是非常重要的。传统的细胞过程检测是一般是通过间接的方法，在大量细胞中采集特定的组分进行分析来获得结果。但是，这些来源于大量细胞的统计性平均结果往往会使细胞过程的真正机理被掩盖。因此，对单细胞或细胞团进行原位检测可以帮助人们更全面深入的认识细胞的个体差异以及细胞间相互作用等问题。拉曼光谱是一种非侵入式、无电离辐射的光学检测方法。与红外和荧光光谱相比，它具有谱峰窄、不受水的干扰、不易猝灭、可用近红外激发等优点，非常适合于溶液状态下的生物体系研究。但是，由于细胞自身的尺寸很小，待测组分的浓度很低，而拉曼散射光的强度又非常微弱，想要获得单个细胞的拉曼光谱是非常困难的。因此，在细胞检测实验中通常要借助一些金属纳米粒子或是金属纳米结构的表面等离子共振来对拉曼信号进行增强，获得细胞的表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectrum,SERS)。其中，金属覆膜微针尖作为一种制备工艺简单、过程可控的SERS增强基底，可以在单细胞或细胞团的非标记原位检测中发挥重要作用。本论文在覆膜微针尖结构、制备工艺、SERS增强效果研究的基础上，针对细胞原位分析的发展趋势和需求，研制了细胞培养及原位监测的小型装置，结合覆膜微针尖的具体应用设计并构建了原位细胞拉曼光谱检测系统。
　　本论文的主要工作和创新点包括:
　　一、设计了无稳定剂包覆的具有SERS效应的覆膜微针尖的结构，确定了其制备方法。
　　以单细胞或细胞团检测为目标，设计了由基底层、偶联层、金属包覆层组成的覆膜微针尖结构。重点讨论了基底层和包覆层的不同制备工艺，确定了熔融拉伸法和磁控溅射法的制备路线。这一制备方法与常用的自组装方法相比较，金属表面无稳定剂包覆层，更易于和生物分子相结合，有利于细胞检测。
　　二、研究了制备参数对微针尖结构形貌和SERS增强效果的影响，得到了优化制备参数。
　　在制备基底层的过程中研究了影响针尖结构形貌的因素，总结出不同锥长和尖端尺寸微针尖的制备参数调整方案。在制备包覆层的过程中系统地研究了影响SERS增强效果的各个因素，对产生影响的机理进行了解释，明确了各因素在制备SERS微针尖中的相互制约关系。
　　三、研制了一种可进行细胞培养及原位监测的小型信息化装置并验证其培养效果。
　　这种小型的信息化装置可与倒置显微镜相结合。通过单片机系统实现对细胞培养环境的实时监测和反馈控制，并且将培养环境数据等重要信息在上位机端实时显示并储存，同时还可以利用GSM模块实现了用户和培养装置的远程交互功能。通过对H08910卵巢癌细胞的培养及原位观察实验，证明该装置具有较好的培养效果。
　　四、构建了原位细胞拉曼检测系统，结合微针尖进行了液相拉曼检测的性能研究，开展了细胞原位检测实验。
　　结合微针尖细胞拉曼检测方案，以光路优化为重点，完成了原位细胞拉曼检测系统的设计、安装和调试。依托该平台，在溶液体系下研究了SERS微针尖相关性能。随后，使用SERS微针尖对A549人肺癌上皮细胞进行了检测实验，验证了系统的实际检测效果。

目录

声明

摘要

本论文专用术语注释表

第一章 绪论

§1．1 拉曼光谱检测技术概述

§1．1．1 光谱检测技术概述

§1．1．2 常用的光谱检测技术

§1．1．3 拉曼光谱

§1．1．4 拉曼光谱检测技术的发展

§1．2 表面增强拉曼光谱与细胞检测

§1．2．1 表面增强拉曼光谱

§1．2．2 单细胞检测技术概述

§1．2．3 基于表面增强拉曼光谱的细胞检测技术

§1．3 本论文的主要工作

第二章 覆膜微针尖的制备及表征

§2．1 引言

§2．2 实验材料及仪器

§2．2．1 实验主要材料

§2．2．2 实验主要仪器

§2．3 覆膜微针尖的结构与功能设计

§2．3．1 覆膜微针尖的结构

§2．3．2 基底层的结构及材料选择

§2．3．3 金属纳米粒子包覆层的比较及选择

§2．3．4 基底层与包覆层的偶联

§2．4 覆膜微针尖的制备

§2．4．1 基底层的制备

§2．4．2 金属纳米粒子包覆层的制备

§2．5 覆膜微针尖的SERS效应研究

§2．5．1 研究内容及实验步骤

§2．5．2 溅射时间对SERS效应的影响

§2．5．3 溅射电流对SERS效应的影响

§2．5．4 针尖曲率对SERS效应的影响

§2．5．5 溅射材料对SERS效应的影响

§2．5．6 偶联剂对SERS效应的影响

§2．6 本章小结

第三章 细胞培养与原位监测的小型装置

§3．1 引言

§3．2 实验材料及仪器

§3．2．1 实验主要材料

§2．2．2 实验主要仪器

§3．3 系统总体设计

§3．3．1 系统框图及功能单元

§3．3．2 系统数据流设计

§3．4 装置实现及稳定性测试

§3．4．1 培养微室单元

§3．4．2 核心处理单元

§3．4．3 远程交互单元

§3．4．4 PCB制板及装置集成

§3．4．5 装置稳定性测试及数据回溯

§3．5 细胞培养及原位观察实验

§3．5．1 细胞复苏

§3．5．2 细胞接种

§3．5．3 MTT比色实验

§3．5．4 细胞培养实验对照结果

§3．5．5 细胞原位观察结果

§3．6 本章小结

第四章 细胞原位拉曼检测平台的构建及应用

§4．1 引言

§4．2 实验材料及仪器

§4．2．1 实验主要材料

§4．2．2 实验主要仪器

§4．3 平台设计与实现

§4．3．1 拉曼散射的激发与采集模式

§4．3．2 平台总体设计

§4．3．3 平台实现

§4．4 覆膜微针尖在液相拉曼检测中的性能研究

§4．4．1 研究内容与实验步骤

§4．4．2 覆膜微针尖在液相拉曼检测中的灵敏度

§4．4．3 覆膜微针尖在液相拉曼检测中的重复性

§4．4．4 覆膜微针尖在液相拉曼连续检测中的稳定性

§4．5 覆膜微针尖在细胞原位拉曼检测实验中的应用

§4．5．1 研究内容与实验步骤

§4．5．2 A549细胞的微针尖SERS检测

§4．6 本章小结

第五章 总结和展望

§5．1 论文总结及主要创新点

§5．2 工作展望

参考文献

攻读博士期间发表的学术论文与申请的专利

致谢