应用TALENs以及CRISPR/Cas9技术构建B细胞缺失免疫缺陷猪模型

摘要

背景：目前应用于临床治疗的多克隆抗体主要来源于志愿者捐献，但是靠志愿者捐献来供应多克隆抗体临床使用受多方面的限制。比如，捐献者可捐献血量较少;具有交叉感染的风险;种类不全，从伦理学角度，很多病毒等致病抗原并不能用来免疫人类。因此，构建可产生人源化抗体的动物模型成为研究重点。猪在解剖结构及生理、免疫特性上与人类比较相近，且用猪作为试验动物模型存在的伦理争议较小，因此可构建人源化猪模型来大量生产人源多克隆抗体。失活猪内源性的免疫球蛋白(Ig)重链铰链区位点可造成VDJ重排障碍，进而抑制IgM蛋白的表达，影响到B细胞的正常发育及猪内源抗体的分泌。如果能在Ig重链位点失活、B细胞缺失的猪模型中，导入人源的相关基因片段，或者在B细胞发育过程中导入人源干细胞，将更有利于人源基因或细胞的互补表达，从而生成人源化嵌合体猪，在猪体内生成人源多克隆抗体。因此，要构建生成人源多克隆抗体的猪模型，首先要构建Ig重链打靶、B细胞缺陷猪。基因打靶猪模型的构建方法通常采用同源重组筛选基因打靶的体细胞，之后进行体细胞克隆的方式。由于传统的同源重组效率非常低，因此基因打靶猪模型的构建费时又费力。近几年，几种新兴的基因组编辑工具——TALENs技术以及CRISPR/Cas9打靶系统相继出现，短时间内被广泛应用于从各种细胞到动物的基因打靶试验并表现出其优越的便捷、高效性。因此，本篇拟采用TALENs以及CRISPR/Cas9系统技术构建IgM敲除、B细胞缺失的免疫缺陷猪模型，为进一步构建人源化抗体猪模型生产人源多克隆抗体打下基础。
　　目的：构建IgM重链敲除、B细胞缺失的免疫缺陷猪模型。
　　方法：⑴由于JH5区是猪基因组上与VDJ重排有关的唯一有功能的JH区域，所以选取IgM重链基因上的JH5区为基因打靶位点，分别根据TALENs以及CRISPR/Cas9构建原则，设计TALENs以及CRISPR/Cas9打靶质粒。⑵应用细胞核转染的方式，分别将构建好的TALENs质粒对或者CRISPR/Cas9系统表达质粒与一定比例的G418表达质粒共转染原代猪胎儿成纤维细胞系。经过G418筛选，挑取单细胞克隆，并经过PCR产物测序的方式确认最终获得目的基因打靶、发生等位基因双突变的单细胞克隆。⑶借助体细胞核移植方法，以筛选获得的IgM基因等位基因双突变的成纤维细胞单克隆混合，作为体细胞核移植供体，最终构建IgM敲除猪。⑷对于构建的克隆小猪，采用提取耳部组织基因组进行靶点位置PCR扩增并PCR产物测序的方式进行基因型鉴定;采用Western Blot免疫印迹法检测IgM蛋白表达情况;流式细胞分析检测血液淋巴细胞中成熟B细胞所占比例;组织学观察主要的二级淋巴器官----肠系膜淋巴结组织中淋巴小结及生发中心等结构完整性;免疫组织化学检测淋巴结组织中T细胞以及B细胞的分布;ELISA分析血浆样本中各类免疫球蛋白表达情况。
　　结果：①根据选取的基因打靶位置，设计并成功组装2对TALENs打靶质粒，用SSA-EGFP报告质粒体外鉴定其打靶效率。流式细胞检测分析数据显示，两对TALENs质粒体外识别切割靶点的效率分别为40.6％和46.8％。进一步用原代猪胎儿成纤维细胞分别转染2对TALENs质粒，筛选得到基因打靶突变细胞的比率分别为7.2％和15.1％;其中可用于体细胞核移植供体的双等位基因突变克隆个数为2个。②同样在IgM重链基因上的JH5区选取CRISPR/Cas9系统打靶位点，成功构建CRISPR/Cas9系统打靶质粒。首先用SURVEYOR酶切的方法鉴定其打靶效率，结果显示构建的CRISPR/Cas9系统打靶效率约为29.3％。CRISPR/Cas9质粒转染猪胎儿成纤维细胞，筛选得到单等位基因突变的单细胞克隆效率为40％，双等位基因突变效率也高达13.3％。用CRISPR/Cas9系统筛选获得的等位基因双突变单细胞克隆个数为6个。③应用体细胞核移植技术，以TALENs以及CRISPR/Cas9筛选获得IgM等位基因双突变细胞为核移植供体，进行两批克隆试验。第一批移植受体猪6头，怀孕2头，其中一头怀孕受体猪在其怀孕35天时，剖出35天胎儿9只，培养猪胎儿成纤维细胞;另外一头怀孕受体猪怀孕足月，自然生产3头健康小猪及2只木乃伊胎。第二批移植受体猪共5头，怀孕受体猪2头，其中2-4号受体猪剖取35天胎儿共12只，培养猪胎儿成纤维细胞;2-5号受体猪怀孕足月，生产5头健康小猪。④两批出生的克隆小猪基因型鉴定结果均为IgM基因靶点位置等位基因双突变，且分别与相应的供体细胞基因型对应;Western Blot试验结果显示，克隆小猪的脾脏组织中几乎没有IgM重链的表达，轻链的表达量与WT型对照猪脾脏样本相比，也明显降低;流式细胞检测分析克隆小猪外周血单个核细胞(PBMCs)中IgM阳性B细胞的含量，发现IgM基因敲除的克隆小猪与野生型小猪相比，PBMCs中IgM阳性B细胞几乎不存在;并且组织学与免疫组织化学检测肠系膜淋巴结组织结构及T细胞、B细胞的分布，发现克隆小猪与野生型小猪相比，其淋巴结组织结构中特征性的淋巴小体、生发中心结构缺失，且B细胞阳性信号几乎没有，而T细胞的数量及分布并无明显变化;ELISA检测结果显示，克隆小猪血浆中IgM、IgG以及IgA的含量与野生型小猪相比明显降低，其中IgM、IgA含量几乎为零，而IgG的少量存在可能来源于喂养的母乳。
　　结论：应用TALENs技术以及CRISPR/Cas9系统，结合体细胞核移植(SCNT)技术可以一步成功构建健康的IgM纯合敲除、B细胞缺失的免疫缺陷猪模型。我们的结果不仅证实了TALENs技术和CRISPR/Cas9技术是构建基因改造猪的高效工具，而且还为利用IgM敲猪模型制备人源化多克隆抗体打下了基础。

目录

声明

全文主要缩略语

摘要

引言

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

实验结果

1．利用TALENs基因打靶技术构建IgM基因敲除的猪成纤维细胞系

2．利用CRISPR／Cas9基因打靶技术构建IgM基因敲除的猪成纤维细胞系

3．IgM基因敲除的猪模型的构建：借助SCNT及子宫移植手术

4．IgM基因敲除克隆猪的鉴定分析

分析与讨论

参考文献

器官移植的发展：从异种器官移植到再生器官生物工程

攻读学位期间发表文章情况及科研工作情况

致谢