妊娠期糖尿病与子痫前期患者胎盘组织的DNA甲基化模式分析

摘要

妊娠期糖尿病和子痫前期是最常见的妊娠期疾病，研究发现二者可能具有相似的疾病起源。近年来越来越多的研究证实，甲基化在各种疾病的发生中发挥着重要的作用。因此，我们打算从甲基化的角度揭示二者发病的共同起源。本研究分为三个部分：
　　第一部分：妊娠期糖尿病患者胎盘组织DNA甲基化模式。
　　目的：越来越多的证据表明胎盘在妊娠期糖尿病(GDM)发病以及表观遗传修饰中发挥着关键的作用。比如DNA的甲基化，它与胎盘的异常发育以及功能异常相关。第一部分的研究目的是为了揭示GDM病人与正常孕妇相比，其胎盘组织的全基因组DNA甲基化的差异。
　　方法：应用甲基化DNA免疫共沉淀和人类CpG island plus promoter芯片技术，筛选鉴定出与GDM相关的异常DNA甲基化基因;使用创新的信号通路分析来确定具有差异表达甲基化基因所涉及到的代谢通路;由于四个能量代谢相关基因(RBP4，Resistin，PPARα and GLUT3)的潜在功能与GDM发病的分子机制有关。因此，我们使用硫酸氢测序PCR(Bisulfatesequencing PCR，BSP)进一步验证了它们的甲基化模式。
　　结果：GDM组与对照组相比，我们的结果发现有包括3148个基因的6181个差异甲基化区域(DMR)表现出显著性的甲基化差异(p＜0.01)，其中有包括1300个基因的高度甲基化的2491个DMRs。同时，我们还发现具有靶向的1848个基因的3690个DMRs表现出显著性的低度甲基化;这些差异表达的甲基化基因主要涉及的信号通路是:细胞生长和凋亡调节路径，神经系统信号通路和炎症相关信号通路;与正常胎盘组织相比，RBP4，Resistin和PPARα在GDM胎盘组织中呈低度甲基化状态，GLUT3呈高度甲基化状态。
　　结论：GDM与对照组之间，全基因的DNA甲基化状态呈显著性差异。胎盘组织甲基化的差异不仅有助于GDM的发生，而且可以胎儿反映发育情况。我们的研究揭示了GDM胎盘组织中DNA甲基化的异常模式，它与GDM的发生有关，而且可以反映异常的胚胎环境。
　　第二部分：子痫前期患者胎盘组织DNA甲基化模式。
　　目的：子痫前期(PE)的出现会严重影响母亲和孩子的健康，但PE的发病机理仍然不清楚，胎盘被认为在其中发挥着重要作用。DNA甲基化也被认为与胎盘发育和功能改变有关。第二部分的研究目的是分析子痫前期病人胎盘组织的全基因组DNA甲基化表达谱。
　　方法：使用甲基化DNA免疫共沉淀和人类CpG island plus promoter芯片技术分析了正常胎盘组织与PE病人的胎盘组织中DNA甲基化状态。候选基因的甲基化状态使用硫酸氢测序PCR(BSP)进行验证。
　　结果：基因芯片分析确定了在PE中具有显著DNA甲基化差异的296个基因，这些基因多位于1号染色体(10.5％，P=0.005)，12号染色体(8.1％，P=0.062)和19号染色体(7.4％，P=0.117)。GO与Pathway分析发现这些基因参与不同的信号途径和生命过程。此外，使用BSP技术在9个PE患者中验证了六个基因（CAPN2，EPHX2，ADORA2B，SOX7，CXCL1和CDX1）的甲基化状态。
　　结论：本研究显示在PE中存在异常的DNA甲基化模式，这可能与PE的病理生理学有关。未来的工作将会探究这些发现在诊断以及治疗上的潜在可能性。
　　第三部分：妊娠期糖尿病患者和子痫前期患者胎盘组织DNA甲基化模式之间的关系。
　　目的：胎盘不仅是胎儿发育过程中母亲和胎儿营养和排泄物交换的通道，而且也起到了调节子宫环境的功能。妊娠期糖尿病(GDM)和子痫前期(PE)是常见的妊娠并发症。病理生理学研究表明这两者有关。表观遗传学支持环境因素之间的相互关联，这些环境因素之前被报道与不良妊娠结局和胎儿发育有关。第三部分的研究目的是研究妊娠期糖尿病患者和子痫前期患者胎盘组织DNA甲基化模式之间的关系。
　　方法：使用甲基化DNA免疫共沉淀和人类CpG island plus promoter芯片技术分析了正常胎盘组织与GDM和PE病人的胎盘组织中DNA甲基化状态。候选基因的甲基化状态使用硫酸氢测序PCR(BSP)进行验证。
　　结果：从目前研究得到的DNA甲基化芯片数据中可以发现，相比于正常孕妇，GDM和PE病人的全基因组的DNA甲基化发生了改变。我们发现来自GDM病人与来自PE病人胎盘组织的甲基化水平变化类似，64.4％的具有异常甲基化的注释基因在两者中表现出同样的变化。值得注意的是，在PE和GDM中受到甲基化影响的基因主要包括一些糖代谢和脂类代谢相关的基因，以及一些参与细胞粘附和细胞分化的基因。
　　结论：我们的研究结果表明了在人的胎盘中，DNA的甲基化模式已经得到了确认，而且与PE和GDM疾病相关，人胎盘组织中DNA甲基化的状态可以作为一个子宫内环境的标志物，而且可能在PE和GDM的发病过程中发挥着作用。

目录

声明

摘要

一、前言

1．妊娠期糖尿病及其发病机制

1．1 妊娠期糖尿病简介

1．2 妊娠期糖尿病发病因素

1．3 妊娠期糖尿病发病机制及其分子生物学基础

2．子痫前期及其发病机制

2．1 子痫前期简介

2．2 子痫前期的发病因素

2．3 子痫前期发病的分子生物学基础

3．二者类似的发病起源

4．甲基化与妊娠相关疾病

4．1 甲基化介绍

4．2 甲基化与妊娠相关疾病

二、材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 妊娠期糖尿病患者胎盘组织、子痫前期患者胎盘组织及对照组样本的收集

2．1．2 主要实验试剂以及仪器

2．1．3 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基因组DNA的提取和准备

2．2．2 基因组DNA的声波降解

2．2．3 基因组DNA的亚硫酸氢钠处理

2．2．4 甲基化DNA的免疫共沉淀以及微芯片分析

2．2．5 芯片数据的加工处理

2．2．6 酸性亚硫酸盐测序PCR(BSP)

2．2．7 基因功能聚类分析(GO分析)

2．2．8 信号通路分析(Pathway分析)以及信号网络

2．3 统计分析

三、实验结果

3．1 妊娠期糖尿病患者胎盘组织DNA甲基化模式

3．1．1 妊娠期糖尿病患者的样本信息

3．1．2 DNA甲基化芯片数据

3．1．3 基因聚类分析

3．1．4 信号通路分析以及信号网络

3．1．5 妊娠糖尿病中4个候选的甲基化基因的确定

3．1．6 讨论

3．2 子痫前期患者胎盘组织DNA甲基化模式

3．2．1 子痫前期患者的样本信息

3．2．2 DNA甲基化芯片表达数据

3．2．3 甲基化异常的基因相关的生物学功能

3．2．4 6个候选基因的甲基化状态的确定

3．2．5 讨论

3．3 妊娠期糖尿病与子痫前期患者具有相似的甲基化模式

3．3．1 妊娠期糖尿病与子痫前期患者的样本信息

3．3．2 子痫前期和妊娠糖尿病病人胎盘组织中的DNA甲基化模式

3．3．3 子痫前期和妊娠糖尿病病人的胎盘组织中差异甲基化位点的一致变化

3．3．4 基因聚类和信号通路分析

3．3．5 筛选基因中的位点特异性的CpG甲基化分析

3．3．6 讨论

四、结论与展望

参考文献

综述：妊娠期糖尿病发病机制的研究进展

附录攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢