ARFP在HCV感染慢性化中的作用及与TBX21基因多态性关系的研究

摘要

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝炎的主要病原体之一，HCV感染极易慢性化，其慢性化率可达75％-85％，约20％的感染者将进展为肝纤维化，甚至肝癌等终末期肝病。HCV感染所引起的丙型肝炎呈全球分布，据WHO统计，目前全世界HCV感染者约有1.8亿人，严重威胁着人类的健康。
　　目前，关于HCV感染慢性化的机制尚未完全阐明。对HCV核心基因密码子移位产生的转框蛋白（alternative reading frame protein，ARFP）的研究表明，ARFP能够引起细胞内NF-κB的持续激活，从而增强细胞抵抗TNF-α诱导凋亡的能力，抑制细胞凋亡，是HCV在细胞内建立持久感染的机制之一。此外，ARFP也可像核心蛋白（Core蛋白）一样，发挥干扰细胞周期，调节细胞增殖、凋亡，诱导免疫应答的作用。
　　我们的研究发现，ARFP抗体阳性率与疾病进程相关，在不同临床类型丙型肝炎患者中，中重度和肝硬化患者ARFP抗体阳性率高于急性丙肝组。另外，ARFP还可能通过调节细胞免疫参与HCV感染的进程和转归。本实验室前期研究结果显示，ARFP阳性HCV患者与ARFP抗体阴性HCV患者相比，血清中γ-干扰素(gamma interferon，IFN-γ)，白细胞介素-2，4，5，10(interluekin，IL-2，IL-4，IL-5 and IL-10)水平呈明显差异，在体外培养的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中，ARFP有上调IL-4、IL-5和下调IFN-γ水平的作用，提示在HCV感染者中，ARFP可能通过影响Th1/Th2平衡，减少细胞损伤，以利于病毒细胞内寄生，导致病毒持续感染。T-bet是促进Th0细胞分化和调控Th1/Th2细胞亚群及细胞因子平衡的关键转录因子，ARFP可能通过影响该转录因子的表达而参与HCV感染的慢性化进展，因此，相关研究具有重要意义。T-bet是由TBX21基因编码的，有研究表明，该基因T-1993Crs4794063)位点变异影响TBX21基因的转录活性，另还有多个SNP位点与多种疾病有关，如T-1514C(rs17250932)、G-1499A(rs2074190)位点SNP与HBV具有相关性，T-1993C rs4794063位点变异还和自身免疫性肝炎，IL-4和TNF-α的表达量有关，但该基因位点变异与HCV疾病进程的相关性，未见相关报道。
　　为了探讨ARFP参与Th1/Th2漂移的分子机制，本课题组构建了HCV1b型ARFP基因的重组质粒pColdⅡ-F，经过镍离子亲和层析纯化后得到高纯度的ARFP。收集慢性HCV1b型患者（chronic hepatitis patient, CHP）的血样，ELISA定性检测ARFP抗体，并依据检测结果分成2组[F-Ab(+)CHP、F-Ab(-)CHP]，收集健康者血样作为对照组。用Westem blotting法检测F-Ab(+)CHP组、F-Ab(-)CHP组和健康对照组的PBMC中T-bet的表达水平，并用不同浓度的ARFP体外刺激PBMC，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中STAT1和STAT6的表达水平，Western blotting法检测磷酸化的STAT1/6水平。结果表明，F-Ab(+)CHP组T-bet表达水平低于F-Ab(-)CHP组，STAT1/6表达水平并不受ARFP刺激的影响，然而，ARFP可影响PBMC中STAT1/6的磷酸化水平。
　　本研究还通过分子流行病学研究方法，对江苏省句容市和镇江市的有偿献血人群进行调查，收集747名慢性HCV患者[190名F-Ab（-），557名F-Ab(+)]和354名健康对照，用改进的多重高温连接酶检测反应(improved multiple ligasedetection reaction，iMLDR)基因分型技术检测TBX21（编码T-bet转录因子）基因三个位点(rs17250932，rs2074190，rs4794067)等位基因的分布频率，采用病例-对照、病例-病例研究设计，分析了中国汉族人群TBX21基因多态性与HCV慢性化进程及ARFP产生的关系。结果表明rs4794067 C等位基因在CHP患者中的分布频率明显高于健康对照者，特别是在F-Ab(+)组。分层分析后发现，在HCV1b基因型亚组和轻度肝纤维化亚组中，rs4794067 C等位基因携带者，和HCV Non-1b基因型亚组中rs2074190 G等位基因携带者，他们在HCV感染进程中，具有更高的ARFP产生风险。而在年轻的女性患者中，rs4794067 C等位基因携带者的慢性化进程的风险更高。本研究提示，TBX21的基因多态性与中国汉族高危人群的HCV感染的慢性化进程和ARFP产生显著相关。
　　本研究综合评价HCV的生物学因素（病毒基因变异）、宿主免疫因素（Th1/Th2平衡）、遗传背景（TBX21基因多态性）和环境因素在HCV感染慢性化进程中的作用及其相互关系，初步探讨HCV ARFP参与Th1/Th2漂移的机制以及宿主因素与ARFP产生的关系，为深入研究病毒性肝炎慢性化的机制提供理论基础，对于探索HCV治疗方法具有一定意义。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 HCV 1b型ARFP的原核表达和纯化

材料与方法

实验方法

结果

讨论

第二部分 HCVARFP及T-bet与HCV慢性化机制的研究

材料与方法

实验方法

结果

讨论

第三部分 中国汉族高风险人群TBX21基因多态性与HCV感染转归和ARFP产生的关联研究

材料与方法

研究对象

结果

讨论

参考文献

小结

综述 HCV感染慢性化的免疫学机制研究进展

附录一 符号及缩略语说明

附录二 攻读学位期间发表论文情况

致谢