低频遗传变异与中国男性非梗阻性无精子症遗传易感性的关联研究

摘要

不孕不育在本世纪已成为人类生殖健康领域最为常见的疾病之一，其预防、诊断和治疗不仅标志着生殖健康水平的高低，也直接关系着人类的生存繁衍。据世界卫生组织(WHO)统计，不孕不育已经影响了世界范围内10-15％的夫妇，其中由于男性问题导致的不育将近50％。而无精子症，即射出的精液中没有精子，是引起男性不育的重要原因。临床上精液经3次离心镜检仍未见精子，且排除不射精和逆行射精等情况后方可确诊。按照有无输精管道梗阻，可将无精子症分为梗阻性和非梗阻性两种。其中非梗阻性无精子症(non-obstructiveazoospermia，NOA)占了很大一部分。流行病学数据表明，成年男性NOA患病率将近1％，对于男性生殖有严重影响。因此，如何识别高危人群，针对性地开展筛查，早期诊断NOA是当前面临的重要挑战。既往研究表明，NOA的形成是环境因素与遗传因素共同作用的结果，其中遗传因素约占男性不育因素的15％-30％。而在相同暴露因素下，遗传背景的差异可能影响个体对NOA的易感性。目前已报道的遗传因素包括:染色体数目异常，Y染色体微缺失，多种生物学通路中基因的突变以及常染色体多态等。在众多遗传因素中，单个常染色体多态位点的效应比较弱，但是在人群中稳定且普遍存在。近年来，全基因组关联研究(Genome-wide Association Studies，GWAS)作为一种探索复杂疾病病因的强有力工具，已经被应用到了NOA病因的研究之中。该技术能快速筛查全基因组范围内的常见遗传标志以发现与特定表型相关的遗传变异，所采用的研究样本量较大，并通常辅以多个独立的研究进行后期的验证和筛选。前期，本课题组通过多阶段病例对照研究先后发现了染色体1p13.3，1p36.32，1q42.13，6p21.32，6p22，10q25.3及12p12.1等七个区域的多个NOA易感基因，从遗传角度出发，解释了部分NOA的发病原因，提示遗传变异在NOA的发病中起着重要的作用。但是，GWAS所发现的常见遗传变异(最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)≥5％)的效应相对较弱(Odds ratio，OR:1.1-1.5)，且88.9％位于基因非编码区或荒漠区，仅能解释NOA的小部分遗传机制。而低频遗传变异(MAF＜5％)的遗传贡献尚不明确，科学家们推测这类遗传变异可能具有更大的效应，对其重要性的忽视或为遗传度遗失的重要原因之一。因此，有必要开展一项基于二代测序筛选技术的外显子关联研究(exome-wide associationstudy, EXWAS)，以系统研究低频遗传变异与中国男性NOA遗传易感性之间的关联。
　　本研究采用多阶段病例对照研究设计对单个遗传变异进行研究:初筛阶段所纳入的病例为2005年4月至2012年1月在江苏省生殖医学中心收治的NOA患者，共962例;对照为从2004年至2006年间在江苏省参与社区慢性非传染性疾病筛查的健康人群中随机选取的男性个体（已婚育），共1，348例。一期验证纳入了来源于江苏及上海地区的714例NOA病例及1，398例有健康生育史男性对照。二期验证则纳入了来源于武汉及沈阳地区的1，454例NOA病例及3，850例有健康生育史男性对照。初筛阶段采用美国Illumina公司的Infinium(R) HumanExome Beadchip芯片对962例NOA病例及1，348例健康对照进行基因分型，该芯片包含了从超过12，000个个体的全基因组测序和外显子组测序数据中挑选出的247，870个遗传变异。在对研究变量和研究对象进行质量控制后，共939例病例和1，335例对照、40，936个低频遗传变异进入后续分析，后期采用logistic回归模型在相加模型下计算遗传变异关联P值、比值比(odds ratio，OR)值以及95％可信区间(confidence interval，CI)。满足以下要求的位点纳入一期验证:1）病例与对照关联P值≤1.0×10-4;2）满足上述标准的位点之间存在高连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)(r2＞0.8)时，仅纳入P值最低的位点;3）位点基因分型图质量较好，分簇清楚。一期验证的位点关联分析结果满足P≤0.05时将进入二期验证。初筛阶段，本研究除对单个遗传位点进行分析外，还运用两种方法进行了以基因为基础的关联分析:Burden test的MAF界值为1％，共纳入6，919个基因;SKAT-O(sequence kernel association optimal test)的MAF界值为5％，共纳入7，979个基因进入后续分析。最终本研究发现了3个与NOA发病风险显著相关的低频遗传变异。其中位于染色体6p22.2区域HISTIH1E基因上的低频遗传变异rs2298090及位于染色体6p21.33区域FKBPL基因上的低频遗传变异rs200847762均显著降低了中国汉族男性患NOA的风险性(rs2298090 A＞G:OR=0.29，95％CI=0.21-0.40，P=6.93×10-14;rs200847762 G＞A: OR=0.10，95％CI=0.05-0.22，P=1.16×10-8);而位于染色体6p21.33区域MSH5基因上低频遗传变异rs11754464 G＞A与NOA发病风险的增加显著相关(OR=1.78，95％CI=1.43-2.22，P=1.03×10-6)。条件分析(Conditionalanalysis)提示，该三个遗传变异为染色体6p21.33、6p22.2区域NOA易感性的独立效应位点。此外，以基因为基础的关联分析发现CFTR基因与NOA发病风险显著相关(P=5.77×10-7)。但是，该基因上的与NOA相关性最显著的遗传变异rs113757788未能在一期江苏及上海地区人群中得到验证。在剔除了该位点之后，CFTR基因与NOA的关联未达到Bonferroni校正后的显著性水平(P=5.05×10-3)。本研究在全外显子范围内筛选了与NOA易感性相关的低频遗传变异，填补了这类GWAS所未能涉及到的遗传变异与NOA发病风险研究的空白。对识别和评价NOA的遗传易感因素，探讨NOA的遗传易感机制，指导NOA的机制研究具有重要理论价值。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1、研究对象

2、实验方法

3、数据处理与分析

结果

1、基于单个遗传变异的关联分析

2、基于基因的关联分析

讨论

总结

参考文献

综述 非梗阻性无精子症遗传易感性研究进展

附录

已发表论文

致谢