基于GWAS的非编码RNA参与胃癌发生发展的机制研究

摘要

胃癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤。全球范围内，胃癌位列全部肿瘤发病率第五位，死亡率第三位。在中国，胃癌发病率和死亡率均占消化系统肿瘤首位，男女发病比例约为2∶1，给我国带来严重的经济负担和社会压力。由于胃癌发病隐匿，且缺乏早期临床特征，大部分患者确诊时已处于进展期;加之目前尚缺乏根治性治疗方案，胃癌患者易发生复发和转移，预后生存效果不佳。因此，加强胃癌病因学和发病机制研究，筛选高效、特异、敏感的生物标志物用于胃癌的预防和治疗，显得尤为重要和迫切。
　　大量流行病资料显示，胃癌发生发展是多基因、多因素参与的多阶段逐步演变的过程，是环境因素、生物因素以及遗传因素、表观遗传因素等共同作用的结果。越来越多研究发现，遗传易感性研究策略为探讨肿瘤病因学和发病机制提供新的思路。全基因组关联性研究(genome-wide association study，GWAS)作为研究肿瘤易感基因的重要手段，发现PLCE1、MUC1和PSCA等众多易感基因参与了胃癌发病过程，为胃癌病因学研究提供重要线索。
　　然而，鉴于GWAS芯片“标签位点”设计特点以及单个位点分析策略，GWAS发现的易感位点仅能解释较小部分的遗传度，掩盖了大量可能具有显著胃癌发病风险指示作用的易感位点。“后GWAS”研究策略的提出是对GWAS的一项重要补充措施。精细作图分析、生物信息学分析、功能学注释以及细胞分子生物学实验等作为“后GWAS”主要研究方案，不仅弥补了缺失的遗传信息，而且从生物学角度阐释了易感基因及位点参与肿瘤发病的作用机制。
　　本研究将基于“后GWAS”研究策略，根据基因遗传变异分布特征，采用基因集分析(gene-set analysis)，深入挖掘胃癌GWAS数据;采用多阶段、多种族人群病例-对照研究设计，进一步明确胃癌易感位点;结合生物信息学分析、公用数据库分析以及一系列细胞分子生物学实验体系，系统揭示胃癌发病风险的可能生物学机制。
　　本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 基于GWAS的非编码RNA遗传变异与胃癌发病风险研究
　　目前，尚未见基于基因类型开展遗传变异分布特征注释的研究报道。在本研究开展前期，我们基于GENCODE基因注释库，对来源1000 Genomes计划的全基因组遗传变异位点、GWAS catalog的肿瘤易感位点以及胃癌高度相关易感位点进行分布特征注释，发现虽然全基因水平上的基因间“荒漠区”位点所占比例最大，但肿瘤易感相关位点的分布逐渐向蛋白编码与ncRNA联合基因（简称:联合基因）偏移，尤其在胃癌中，联合基因上易感位点所占比例已高达62.1％。我们推测，联合基因在胃癌发生发展过程中可能发挥着重要生物学调控作用。
　　基于上述科研假说，我们对胃癌GWAS数据按照蛋白编码基因、ncRNA基因、联合基因以及基因间分布进行基因集分析，发现联合基因上位点集合效应与胃癌易感相关性最为显著(p=1.14×10-24)。该结果再次提示联合基因与胃癌发生发展关系密切，为胃癌病因学研究提供思路。
　　为进一步确定联合基因集中的胃癌易感基因，我们在以各基因为单位的基因集分析中，发现一个新型的胃癌易感基因GCLET(gastric cancer low-expressedtranscript)。通过功能学注释、独立效应分析、自然进化选择分析以及多阶段、多种族人群（亚洲人种:共5，332病例、6，452对照;欧美人种:254病例、2，835对照）的关联性分析，发现具有潜在生物学效应的GCLET rs3850997 T＞G位点可显著降低胃癌发病风险(OR=0.87，Pmeta=5.34×10-7)。随后，我们通过胃癌组织学验证以及报告基因、EMSA和ChIP等细胞分子生物学实验，进一步探讨rs3850997可能具有的等位基因特异性转录活性。研究发现，G等位基因能够降低抑制性转录因子CTCF的亲和力，进而促进GCLET基因转录，实现对胃癌易感的保护效应。
　　本研究是首次对胃癌GWAS开展的基因集分析，为“后GWAS”时代的研究提供重要方法借鉴和数据参考，并为易感位点的遗传调控机制研究提供重要思路和线索。
　　第二部分 lncRNA GCLET参与胃癌发生发展的分子机制研究
　　大量研究结果表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）作为表观遗传学中重要组成部分，参与了细胞生长、分化等生理过程以及包括恶性肿瘤在内的复杂疾病的病理过程。本部分对第一部分关联性研究定位的易感基因lncRNA GCLET开展深入的分子作用机制研究以探讨其在胃癌发生发展过程的重要调控作用。
　　结合临床流行病学资料，分析GCLET与临床表型相关性;并观察GCLET对细胞恶性表型的影响。此外，通过报告基因、细胞干扰和Western blot等细胞分子生物学实验，以及胃癌组织学验证，检测胞质中高丰度lncRNAGCLET是否具有“海绵”样作用吸附miRNAs，发挥“竞争内源性RNA(competingendogenous RNA，ceRNA)”效应。
　　研究发现，lncRNA GCLET对胃癌细胞恶性增殖、侵袭和迁移具有显著抑制效应，进而参与了胃癌病程进展（浸润深度Ptrend=0.037;淋巴转移Ptrend=0.019;临床分期Ptrend=0.003）以及预后转归（logrank P=0.005）。生物信息学分析和细胞分子生物学实验证实，GCLET可竞争性结合miR-27a-3p，抑制其对下游靶基因FOXP2的翻译活性，形成“GCLET-miR-27a-3p-FOXP2”作用通路参与胃癌发生发展。
　　本部分研究所开展的临床表型与细胞表型结果相辅相成，互为验证，为GCLET作为临床治疗效果评价、病程跟踪和预后判断的潜在生物标志物提供重要参考;同时深入细致的分子作用机制研究也为GCLET临床应用价值的实现提供理论支撑。

目录

声明

摘要

序言

第一部分 基于GWAS的非编码RNA遗传变异与胃癌发病风险研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 IncRNA GCLET参与胃癌发生发展的分子机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 后GWASs的生物学机制研究进展

附录

个人简介

致谢