miR-144-451基因簇与食管癌发病关系研究

摘要

miRNA可以与mRNA的3'UTR区结合，调控相应编码蛋白表达，在基因转录后调控中发挥重要作用。miRNA调控异常可致机体细胞功能异常，研究发现miRNA异常表达与肿瘤发生密切相关，miRNA可能成为肿瘤诊断的重要分子标志物。部分miRNA的编码基因在染色体上位置紧邻，成簇排列形成miRNA基因簇，研究发现这些成簇排列的miRNA在表达和功能上具有较高的相关性，miRNA基因簇可能作为一个功能单位，整体调控生物信号传导通路。作为潜在的生物标志物，miRNA基因簇能够更好的反映miRNA对机体复杂的网络调控，因而更加灵敏、可靠。本研究在江苏省淮安食管癌患者食管癌组织和癌旁组织中分析了miR-144-451基因簇的表达特征，探讨了miR-144-451基因簇异常表达与食管癌发病风险的关系;并进一步在miR-144-451基因簇的稳转细胞模型中初步探讨了miR-144-451基因簇在食管癌发生发展中的生物学功能及调控机制。
　　一、miR-144-451基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究
　　招募淮安市第一人民医院2011～2012年101例病理确诊食管癌患者。使用QRT-PCR技术分别检测食管癌组织和配对癌旁组织中miR-144-451基因簇单一miRNA(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p)的表达，与癌旁组织相比，食管癌组织中miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a显著低表达，其表达量2-△△CT分别是癌旁组织的37.6％、46.7％、44.3％，miR-4732-5p、miR-4732-3p的表达在癌组织和癌旁组织中没有统计学差异。
　　应用单纯病例研究分析环境因素与miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a表达改变之间的关系，结果显示miR-144-3p、miR-144-5p的异常表达与喜食硬食有交互作用，miR-144-5p、miR-451a异常表达与饮水类型有交互作用(P＜0.05）。
　　基于miR-144-451基因簇内的miRNAs可能存在共表达的特征，对各miRNA表达量经数据转换后进行Pearson相关性分析，结果显示5种miRNA两两之间表达相关性均具有统计学意义(P＜0.001)，其中miR-4732-5p与miR-144-5p表达高度相关(r=0.731)。进一步应用主成分Logistic回归分析，识别了miR-144-451基因簇中的两个代表性miRNAs: miR-144-3p和miR-144-5p,两者的低表达可增加食管癌的发病风险。
　　二、miR-144-451基因簇对食管癌细胞生物行为影响
　　1.使用miRNA mimics转染EC9706细胞，分别获得miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达细胞模型，研究分析基因簇中各miRNA对细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、和凋亡能力的影响。
　　(1)使用流式细胞术(AnnexinⅤ-FITC标记)检测miRNA mimic转染48h后细胞的凋亡率，miR-144-3p过表达细胞早期凋亡率为(18.70±2.11)％，较对照组(9.00±1.15)％明显升高(P＜0.05）。miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达细胞凋亡率分别为（8.43±3.26）％、(10.00±0.90)％、（9.73±0.64）％、（9.40±0.61）％，与对照组相比凋亡率差异均没有统计学意义。
　　(2)使用流式细胞技术(PI染色）检测miRNA mimic转染48h后细胞的周期分布。miR-451a过表达细胞中G2期所占比例为(22.84±0.97)％，与对照组(18.20±1.12)％相比增加了25％。miR-144-3p过表达细胞中G2期所占比例(14.62±1.41)％与对照组(18.20±1.12)％相比下降了20％。
　　(3)使用Transwell小室检测细胞的迁移能力，miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p可以抑制EC9706细胞的迁移能力，其对应转染组穿膜细胞数分别为15.63±1.00、21.27±1.70、26.97±3.47，较对照组(36.67±3.58)穿膜细胞数均有明显降低。miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p穿膜细胞中结晶紫OD值低于对照组，差异有统计学意义。
　　(4)使用Transwell小室检测细胞侵袭能力，miR-144-3p过表达细胞穿膜数为12.07±1.10，明显低于对照组穿膜细胞数(25.90±2.26)。miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p过表达对细胞的侵袭能力无影响。
　　(5)使用EdU染色成像法检测细胞增殖能力，miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p过表达细胞增殖率分别分别为(34.18±5.83)％、(33.56±3.94)％、(34.15±2.94)％、(31.50±2.01)％，与对照组(41.16±2.13)％相比，四组细胞增殖率均降低。
　　2.构建pri-miR-144-451过表达载体，使用慢病毒包装并转染，经抗生素筛选获得稳定表达pri-miR-144-451细胞。分别检测稳定表达pri-miR-144-451 EC9706细胞的凋亡、周期、迁移、侵袭、增殖能力，以评价miR-144-451基因簇整体对食管癌细胞影响。结果显示miR-144-451基因簇可以导致EC9706细胞周期阻滞于S和G2期，发挥抑癌基因作用;miR-144-51基因簇可以明显抑制EC9706细胞的侵袭能力，与对照细胞相比pri-miR-144-451过表达并没有引起细胞凋亡、侵袭、增殖能力的改变。
　　三、miR-144-451基因簇在EC9706中调控通路分析
　　1.使用Targetscan、miRanda、miRDB、PICTAR预测miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a的靶基因，对预测的靶基因使用DAVID Bioinformatics Resources6.7进行生物学功能富集分析，结果显示miR-144-3p的靶基因最多富集在转录调控功能，其次为细胞形态功能。miR-144-5p的靶基因最多富集在转录调控功能，其次为转录功能。miR-451a的靶基因最多富集于增殖调控功能。
　　2.使用Western Blot分别检测miRNA mimic(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p、miR-control)转染细胞、pri-miR-144-451稳转细胞(pri-miRNA、pri-control)中相应蛋白的表达。蛋白的相对表达量A=目的蛋白IOD/内参IOD。
　　(1)miRNA mimic转染组和pri-miRNA组β-Catenin总蛋白、非磷酸化β-Catenin蛋白表达无改变，miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p处理组细胞中磷酸化β-Catenin的表达与miR-control对照组相比略有增加。与对照组相比，pri-miRNA组磷酸化β-Catenin表达增加。
　　(2)与对照相比miR-144-3p处理组c-Myc总蛋白表达降低，miR-144-5p处理组c-Myc总蛋白表达升高;与pri-control组相比pri-miRNA组细胞中c-Myc总蛋白表达升高。miR-144-3p组细胞磷酸化c-Myc蛋白表达降低，pri-miRNA组磷酸化c-Myc表达升高。
　　(3)不同处理组间PTEN和ERK1/2表达无差异。miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p组磷酸化ERK1/2表达较miR-control组降低;pri-miRNA组磷酸化ERK1/2表达低于pri-control组。
　　(4)miR-4732-5p处理组p53表达明显升高;pri-miRNA组p53蛋白表达较pri-control组升高。miR-144-3p过表达组非活化Caspase3表达较miR-control组表达降低。
　　(5)与miR-control组相比，miR-144-3p、miR-4732-5p转染组细胞MMP9表达降低;pri-miR-144-451稳转细胞中MMP9呈低表达。
　　(6)miR-144-3p、miR-144-5p过表达细胞磷酸化cdc2表达较miR-control组表达降低。pri-miRNA组磷酸化Cdc2表达则明显增加。
　　四、主要结论:
　　(1)miR-144-451基因簇成员miRNA在食管癌和癌旁组织中表达高度相关，miR-144-451基因簇中miR-144-3p、miR-144-5p低表达可增加食管癌的发病风险，是食管癌的危险因素。
　　(2)miR-144-451基因簇可以抑制食管癌细胞的侵袭能力，使食管癌细胞G2、S期细胞增加，G1期细胞减少。其中miR-144-3p可以促进食管癌细胞早期凋亡;miR-451a可以使细胞周期阻滞于G2期;miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p抑制细胞迁移;miR-144-3p可以抑制食管癌细胞侵袭能力;miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p可以抑制细胞增殖能力。
　　(3)miR-144-451基因簇可以抑制Wnt通路、MAPK/ERK/c-Myc信号通路。miR-144-451基因簇过表达导致MMP9被抑制，周期相关蛋白的p-cdc2表达升高，食管癌细胞周期、侵袭抑制可能与此有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 miR-144-451基因簇与食管癌发病风险的病例对照研究

第一节 miR-144-415基因簇单一miRNA的表达研究

第二节 miR-144-451基因簇与食管癌发病风险研究

第二章 miR-144-451基因簇对食管癌细胞生物学行为的影响

第一节 miR-144-415基因簇单一miRNA生物学功能研究

第二节 miR-144-451基因簇对食管癌细胞生物学功能的影响

第三章 miR-144-451基因簇在食管癌细胞中调控通路分析

第一节 miR-144-451基因簇靶基因的预测与分析

第二节 miR-144-451基因簇调控通路分析

总结

参考文献

综述 miR-144-451基因簇与肿瘤

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致谢