MSC旁分泌VEGF/HGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺损伤修复的作用及机制研究

摘要

第一部分 VEGF/HGF稳定低表达的MSC构建及鉴定
　　目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)/肝细胞生长因子(HGF)稳定低表达的骨髓来源的间充质干细胞(MSC)。
　　方法:
　　(1)采用直接贴壁法从SD大鼠骨髓分离、纯化获得MSC，并通过流式细胞学检测表面标志物和诱导成脂、成骨、成软骨分化以对其进行鉴定;
　　(2)构建携带VEGF或HGF基因干扰序列的慢病毒质粒，设立只表达绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)的无意义序列作为空白对照质粒，然后分别通过Polybrene与质粒LV3（携带GFP&Puro）-NC，LV3（携带GFP&Puro）-VEGFA-Rat-1536和LV3(携带GFP&Puro)-HGF-Rat-591分别感染293T细胞进行质粒的包装，然后用所获得的携带目的基因干扰序列的慢病毒转染MSC，用嘌呤霉素(Puromycin)进行药物筛选，挑取克隆纯化传代培养10代后，荧光显微镜下观察报告基因GFP阳性细胞，并拍照计数分析GFP阳性细胞比率评估转染效率;
　　(3)qRT-PCR(Quantitative real-timepolymerase chain reaction)法、Western blot法以及ELISA法分别检测MSC内VEGF或HGF mRNA水平、目的蛋白表达水平以及细胞外目的蛋白分泌水平以评估基因干扰效果;(4)体外划痕实验及Transwell小室迁移实验评估基因干扰对MSC水平和垂直迁移能力的影响。
　　结果:
　　(1)分离纯化后的MSC为成纤维细胞样，SD大鼠骨髓来源的MSC表面表达CD90、CD44、CD34，阳性率≥70％，而不表达CD29、CD45、CD11b/c，阳性率≤5％，且可体外诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞;
　　(2)慢病毒介导VEGF或HGF基因干扰的MSC，传代培养10代后，荧光蛋白GFP的携带率仍高达90％以上;
　　(3)VEGF基因干扰后，MSC内VEGF mRNA水平明显下降(P＜0.05)，VEGF蛋白表达水平明显减低(P＜0.05)，MSC对VEGF的分泌亦明显减少(P＜0.05);HGF基因干扰后，MSC内HGF mRNA水平明显下降(P＜0.05)，HGF蛋白表达水平明显减低(P＜0.05)，MSC对HGF的分泌明显减少(P＜0.05);
　　(4)与野生型MSC相比，VEGF/HGF基因干扰后MSC的水平和垂直迁移能力无明显变化(P＞0.05)，提示从理论上来说，MSC-ShVEGF/MSC-ShVEGF具有与MSC同等的向损伤部位归巢的能力。
　　结论:借助慢病毒载体介导的VEGF或HGF基因干扰技术，成功构建了对VEGF/HGF稳定低表达且仍具备向损伤组织归巢能力的MSC细胞株，从而为进一步在体实验明确旁分泌VEGF/HGF在MSC改善ALI肺微血管通透性和促进肺损伤修复中的作用和机制奠定了可靠的基础。
　　第二部分 MSC旁分泌VEGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺损伤修复的影响
　　目的:研究MSC旁分泌VEGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺损伤修复的影响。
　　方法:SD大鼠随机分为NS+PBS组（正常对照组），LPS+PBS组（ALI组），LPS+MSC组(MSC治疗组)，LPS+MSC-GFP组（MSC-GFP治疗组），LPS+MSC-ShVEGF组(VEGF基因干扰的MSC治疗组)，气道内滴入LPS复制大鼠ALI动物模型，按分组经不同处理后，1h、6h和24h处死大鼠并留取肺组织标本。
　　①计算肺湿重与体重比(LWW/BW)以及伊文思兰实验评估肺水肿和肺血管通透性情况;
　　②免疫荧光染色评估MSC移植后24小时肺组织中黏附连接蛋白VE-Cadherin的表达水平;
　　③TUNEL染色检测MSC移植后24小时肺血管内皮细胞凋亡情况;
　　④HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;
　　⑤ELISA检测肺部炎症因子IL-1β和IL-10水平评价肺部炎症程度;
　　⑥ELISA检测肺组织VEGF蛋白水平。
　　结果:
　　①MSC-ShVEGF移植对ALI肺微血管通透性的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组LWW/BW在MSC移植治疗后24小时明显升高(P＜0.05)，MSC-ShVEGF组对伊文思兰的通透性在MSC移植治疗后6小时和24小时均明显升高(P＜0.05);
　　②MSC-ShVEGF移植对ALI肺组织细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin表达水平盼影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组肺组织细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin表达水平在MSC移植治疗后24小时明显下降(P＜0.05);
　　③MSC-ShVEGF移植对ALI肺血管内皮细胞凋亡的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组肺血管内皮细胞凋亡在MSC移植治疗后24小时明显增加(P＜0.05);
　　④MSC-ShVEGF移植对ALI肺组织病理的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组肺组织病理损伤和肺损伤评分在MSC移植治疗后24小时明显升高(P＜0.05);
　　⑤MSC-ShVEGF移植对ALI肺部炎症的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组肺部促炎因子IL-1β的表达水平明显增高，而抑炎因子IL-10的水平明显降低(P＜0.05);
　　⑥MSC-ShVEGF移植对ALI肺组织VEGF表达水平的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShVEGF组肺组织中VEGF的表达水平在MSC移植治疗后24小时明显降低(P＜0.05)。
　　结论:
　　①MSC通过旁分泌VEGF有利于稳定LPS诱导的ALI大鼠肺组织细胞间连接结构、减少肺血管内皮细胞凋亡从而降低肺组织肺血管通透性，调节肺部炎症反应失衡，减轻肺组织病理损伤;
　　②这些肺保护效应可能是MSC通过旁分泌VEGF纠正ALI肺部VEGF水平而实现的。
　　第三部分 MSC旁分泌HGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺损伤修复的影响
　　目的:研究MSC旁分泌HGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺损伤修复的影响。
　　方法:SD大鼠随机分为NS+PBS组（正常对照组），LPS+PBS组（ALI组），LPS+MSC组（MSC治疗组），LPS+MSC-GFP组（MSC-GFP治疗组），LPS+MSC-ShHGF组(HGF基因干扰的MSC治疗组)，气道内滴入LPS复制ALI大鼠动物模型，按分组经不同处理后，1h、6h、24h和48h处死大鼠并留取肺组织标本。
　　①计算肺湿重与体重比以及伊文思兰实验评估肺水肿程度和肺血管通透性情况;
　　②HE染色行肺组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;
　　③免疫荧光染色定位评估MSC移植后24小时肺组织中黏附连接蛋白VE-Cadherin的表达情况;
　　④TUNEL染色检测MSC移植后24小时肺血管内皮细胞凋亡情况;
　　⑤ELISA检测肺部炎症因子IL广1β和IL-10水平评价肺部炎症程度;
　　⑥免疫组化检测MSC移植后24小时肺组织MSC的存留情况;
　　⑦ELISA检测肺组织HGF蛋白水平。
　　结果:
　　①MSC-ShHGF移植对ALI肺微血管通透性的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组LWW/BW在MSC移植治疗后24小时明显升高(P＜0.05)，MSC-ShHGF组肺血管对伊文思兰的通透性在MSC移植治疗后6小时和24小时均明显升高(P＜0.05);
　　②MSC-ShHGF移植对ALI肺组织细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin表达水平的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺组织细胞间黏附连接蛋白VE-cadherin表达在MSC移植治疗后24小时明显减少(P＜0.05);
　　③MSC-ShHGF移植对ALI肺血管内皮细胞凋亡的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺血管内皮细胞凋亡在MSC移植治疗后24小时明显增加(P＜0.05);
　　④MSC-ShHGF移植对ALI肺组织病理的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺组织病理和肺损伤评分在MSC移植治疗后24小时明显升高(P＜0.05);
　　⑤MSC-ShHGF移植对ALI肺部炎症的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺组织促炎因子IL-1β的表达水平明显增高，而抑炎因子IL-10的水平明显降低(P＜0.05);
　　⑥MSC-ShHGF移植后24小时MSC在损伤肺组织的存留情况:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺部MSC的存留在MSC移植治疗后24小时无明显改变(P＞0.05);
　　⑦MSC-ShHGF移植对ALI肺组织HGF表达水平的影响:与MSC或MSC-GFP组相比，MSC-ShHGF组肺部HGF的表达水平在MSC移植治疗后24小时和48小时明显降低(P＜0.05)。
　　结论:
　　①MSC旁分泌HGF能稳定LPS诱导的ALI大鼠肺组织细胞间连接结构、减少肺血管内皮细胞凋亡而降低肺组织肺血管通透性，调节肺部炎症反应失衡，减轻肺组织病理损伤;
　　②MSC通过旁分泌HGF可以上调ALI时肺部HGF水平，从而发挥对ALI肺组织的保护作用。

目录

声明

摘要

本论文专用缩略词表(Abbreviations)

前言

参考文献

文献综述一 间充质干细胞旁分泌机制在ARDS治疗中的研究进展

文献综述二 多糖包被在ARDS中的作用

主要实验材料、仪器与试剂

第一部分：VEGF／HGF稳定低表达的MSC构建及鉴定

参考文献

第二部分 MSC旁分泌VEGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺组织损伤修复的影响

参考文献

第三部分 MSC旁分泌HGF对ALI大鼠肺微血管内皮通透性和肺组织损伤修复的影响

参考文献

结论

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