DSG2F536C Knock-In小鼠模型的病理表型及其致病机制的初步研究

摘要

第一部分 DSG2F536C Knock-In小鼠的建立及病理表型研究
　　背景:致心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）的病理特征为心肌进行性地被纤维和/或纤维脂肪组织替代，临床好发各种室性心律失常，是引起心源性猝死的重要原因之一。近年来，分子遗传学研究揭示约50％以上的ARVC患者携带有桥粒基因突变。我们前期对中国汉族DS家系ARVC患者进行基因筛查，发现编码桥粒芯糖蛋白(Desmoglein-2，DSG2)基因发生变异c.1592T＞G，导致第531位的半胱氨酸被苯丙氨酸替代(DSG2F531C)，但该突变是否具有致病性还缺少最直接的证据。
　　目的:建立DSG2F536C Knock-In小鼠模型，观察该小鼠模型心脏病理表型特征。
　　方法:采用同源重组靶基因敲入技术构建DSG2F536C Knock-In小鼠模型，对小鼠尾DNA的PCR扩增鉴定小鼠的基因型;Masson染色、H&E染色和油红O染色观察DSG2F536C Knock-In小鼠心肌病理学改变;透射电镜(TEM，Transmission electron microscopy)观察小鼠心脏超微结构;免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和Western blot检测分别观察小鼠心脏DSG2蛋白的亚细胞定位和表达。
　　结果:成功构建了3种基因型的DSG2F536C Knock-In小鼠，分为纯合型组（DSG2m/m）、杂型组（DSG2m/+）和野生型组（DSG2+/+）。结果如下:(1)常规病理检查:2周龄时，DSG2+/+小鼠、DSG2m/+小鼠和DSG2m/m小鼠均未见明显异常。10周龄时，DSG2m/m小鼠的右心室出现心肌排列紊乱、纤维化和炎性反应，约1/3的小鼠同时累及左心室，同时纤维化区域可见脂肪浸润，而DSG2m/+小鼠仅见心肌排列紊乱。(2)胶原容积分数(Collagen volume fraction，CVF):与DSG2+/+和DSG2m/+小鼠相比，DSG2m/m小鼠右心室的CVF明显增加（DSG2+/+vs.DSG2m/m，3.46％±1.94％ vs.24.72％±2.23％，P＜0.001;DSG2m/+ vs.DSG2m/m，3.14％±1.46％ vs.24.72％±2.23％，P＜0.001），而DSG2m/+小鼠的右心室的CVF与DSG2+/+小鼠之间无明显统计学差异(P＞0.05)。而左心室的CVF，在三组之间均无显著统计学差异（P＞0.05）。(3) TEM: DSG2+/+和DSG2m/+可观察到典型的桥粒结构，而DSG2m/m小鼠未观察到类似结构，且可观察到心脏闰盘区明显增宽、线粒体减少。(4) IHC和Western blot: IHC的结果显示DSG2m/m小鼠心脏闰盘区未见DSG2蛋白的表达，而DSG2+/+小鼠和DSG2m/+小鼠均在闰盘区正常表达。Western blot检测各组小鼠心脏总的DSG2蛋白的表达，结果提示与DSG2+/+小鼠（0.482±0.188）和DSG2m/+小鼠（0.388±0.090）相比，DSG2m/m小鼠的DSG2蛋白（0.004±0.003）几乎不表达，而DSG2+/+小鼠和DSG2m/+小鼠的DSG2蛋白表达无显著差异(P＞0.05)。
　　结论:10周龄DSG2m/m小鼠出现类似于临床ARVC患者的疾病特征，包括以右心室为主的炎性反应、心室纤维化和脂滴浸润等大体病理改变，桥粒结构异常、闰盘区增宽和线粒体减少等超微表型，以及DSG2蛋白表达异常等，提示DSG2F536C突变为ARVC的致病性突变，为进一步深入研究DSG2F536C突变导致ARVC的发病机制提供了良好的动物模型。
　　第二部分 DSG2F536C突变导致ARVC机制的初步研究
　　背景:现已知，致心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricularcardiomyopathy，ARVC）的发病机制涉及多种信号通路的调控，包括Wnt信号通路的抑制、Hippo信号通路的激活、iASPP信号通路的下调和TGF-β1信号通路的激活等。我们成功构建了DSG2F536C Knock-In小鼠，研究显示该模型小鼠具有炎性反应、钙化、心室纤维化和脂滴浸润等类似于人类ARVC的表型，提示该突变为致病性突变。然而，DSG2F536C致ARVC的分子机制目前尚未明确。目的:探讨DSG2F536C突变致ARVC的发病机制是否涉及Wnt信号通路、Hippo信号通路、iASPP信号通路和TGF-β1信号通路。
　　方法:以DSG2F536C Knock-In小鼠为实验动物模型，分为纯合型小鼠组（DSG2m/m）、杂型小鼠组（DSG2m/+）和野生型小鼠组（DSG2+/+）。观察各信号通路的主要蛋白的表达:(1) Wnt信号通路:应用IHC测定盘状球蛋白(plakoglobin，PG)的亚细胞定位情况，Western blot测定PG的表达;(2)Hippo信号通路:Western blot检测Yes相关蛋白(Yes associated protein，YAP)及其磷酸化产物(P-YAP);(3) iASPP信号通路:Western blot检测p53凋亡刺激蛋白抑制物（inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53，iASPP）的表达;(4) TGF-β1信号通路:Western blot检测转化生长因子β1（transfominggrowth factorβ1，TGF-β1）的表达。
　　结果:(1) Wnt信号通路:IHC的结果显示DSG2+/+、DSG2m/+和DSG2m/m小鼠的PG正常定位于心脏闰盘区，且Western blot结果及其半定量分析提示PG蛋白的表达量在三组小鼠之间未见明显差异(P＞0.05);(2) Hippo信号通路:Western bolt结果显示P-YAP、YAP的表达以及P-YAP/YA的比值在三组小鼠之间未见显著统计学差异(P＞0.05);(3) iASPP信号通路:Western bolt结果提示iASPP蛋白表达在三组小鼠之间未见明显统计学差异(P＞0.05);(4)TGF-β1信号通路:Western bolt结果显示，与DSG2+/+小鼠相比，DSG2m/+和DSG2m/m小鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达显著升高（DSG2+/+ vs.DSG2m/+，0.202±0.010 vs.1.048±0.444，P＜0.05; DSG2+/+ vs.DSG2m/m,0.202±0.010 vs.0.814±0.347，P＜0.05），而DSG2m/+小鼠和DSG2m/m小鼠之间的心肌组织TGF-β1蛋白表达未见明显差别（P＞0.05）。
　　结论:TGF-β1信号通路的激活，可能参与DSG2F536C Knock-In小鼠模型ARVC的发病过程，本研究为进一步深入探讨DSG2F536C致ARVC的发病机制提供了研究基础。

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论文主要缩略语英中文对照

摘要

前言

第一部分 DSG2F536C Knock-In小鼠的建立及病理表型研究

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 DSG2F536C突变导致ARVC机制的初步研究

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 致心律失常性右室心肌病的发病机制研究进展

攻读硕士学位期间发表文章

致谢