G6PD对苯暴露小鼠骨髓细胞信号通路影响的研究

摘要

苯是一种常见的环境污染物。长期慢性苯暴露可引起造血系统的损害，主要表现为白细胞和血小板减少，严重者出现再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症，甚至白血病。
　　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是磷酸戊糖通路的限速酶。G6PD缺乏症是一种常见的X染色体连锁不完全显性遗传病，俗称“蚕豆病”，全球近4亿人患病。课题组前期研究表明，G6PD缺陷可以增加K562细胞和小鼠苯暴露所致的氧化应激和毒性损伤，但G6PD对苯毒性调控的机制不清，本研究应用G6PD低表达的C3H/He小鼠动物模型(G6pdxa-m1Neu)，苯染毒后对小鼠的骨髓细胞进行RNA-seq检测，通过生物信息学分析，探讨G6PD对苯毒性调控的通路，并对谷胱甘肽代谢通路进行了验证。
　　1.应用RNA-seq研究G6PD缺陷对苯暴露小鼠骨髓细胞mRNA表达谱的影响
　　以160mg/(kg.d)浓度的苯皮下注射染毒G6PD低表达C3H/He小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠。染毒结束后，提取小鼠骨髓细胞进行RNA-seq检测，采用qRT-PCR对RNA-seq结果的准确性进行验证。
　　G6PD低表达小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠比较共筛选到486个差异表达基因，其中209个基因上调表达，277个基因下调表达;G6PD正常C3H/He小鼠苯染毒前后比较共筛选到227个差异表达基因，其中下调为122个，上调为105个;相同苯染毒浓度下，G6PD低表达小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠比较共筛选到223个差异表达基因，其中上调为105个，下调为118个。qRT-PCR验证结果显示目的基因相对表达量与RNA-seq的结果是一致的，证明RNA-seq的结果是可靠的。
　　以上结果说明G6PD缺陷可对苯暴露小鼠骨髓细胞mRNA表达谱产生明显影响，RNA-seq的结果是可靠的。
　　2.G6PD对苯毒性调控的通路研究
　　本研究通过对不同组间差异基因进行GO、KEGG Pathway和基因共表达分析，获得可能的通路，推测G6PD低表达对小鼠苯暴露后信号通路的调控网络与机制。
　　G6PD低表达小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠的差异表达基因主要富集在代谢、氧化还原过程、凋亡、免疫、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢、氧化应激、造血细胞谱系、NADPH再生、HIF-1、NF-KB、AMPK、PI3K-Akt、VEGF以及糖尿病、结核、哮喘等相关的疾病通路;G6PD正常C3H/He小鼠苯染毒前后的差异表达基因主要富集在免疫、凋亡、代谢、氧化应激、细胞周期、细胞生长、T细胞分化、谷胱甘肽代谢、造血细胞谱系、HIF-1、P53、Jak-STAT、PI3K-Akt、NF-KB、急性髓性白血病等相关的功能和通路;相同苯染毒浓度下，G6PD低表达小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠的差异表达基因主要富集在代谢、磷酸戊糖、应激反应、氧化还原反应、NADPH再生、凋亡、谷胱甘肽代谢、脂肪酸代谢、炎症、MAPK、ErbB、GnRH、HIF-1、TNF、VEGF、NF-KB信号通路、急性髓性白血病等相关功能和通路上，通过差异基因共表达分析发现，发现调控能力较高的基因主要有G6pdx、Ltb、Siglece、Orai1、Hck、Lmo4、Atp6v0b、Gm14010、Cmah、Prr13、Pde3b、Ckap4、Csrp1、P2ry6。
　　以上研究结果说明，G6PD低表达与苯暴露都可导致骨髓细胞信号通路的显著变化，G6PD低表达主要通过影响谷胱甘肽代谢通路、磷酸戊糖通路、氧化应激、凋亡、代谢、造血谱系等相关通路影响苯对骨髓细胞的毒性。
　　3.GSH干预对G6PD低表达细胞1，4-苯醌毒性的影响
　　本部分主要通过GSH干预1，4-BQ对G6PD正常与低表达K562细胞株的毒性影响，验证谷胱甘肽代谢通路是G6PD对苯毒性影响的通路之一。以20μmol/L1，4-BQ处理G6PD低表达细胞和阴性对照细胞，GSH干预浓度为0.16mmol/L。通过MTT、ROS、凋亡、彗星实验检测GSH干预对1，4-BQ毒性的影响。同时，选取碳代谢及谷胱甘肽代谢通路相关基因G6PD、Pgk1、Pgd，检测GSH干预后的mRNA水平的变化。
　　结果显示，G6PD低表达能使1，4-苯醌所致的K562细胞ROS增加，细胞增值率降低，凋亡率增高，DNA损伤加重。GSH干预后可使G6PD低表达细胞和阴性对照细胞之间ROS含量、凋亡率、DNA损伤、细胞增值率的差异明显减小。GSH干预可降低Pgk1、Pgd在G6PD低表达细胞和阴性对照细胞之间的mRNA差异变化水平。结果说明谷胱甘肽代谢通路是G6PD对苯毒性影响的重要通路之一。
　　总结：
　　本研究通过应用G6PD低表达的小鼠动物模型，对G6PD低表达C3H/He小鼠和G6PD正常C3H/He小鼠进行苯染毒，然后取小鼠的骨髓细胞进行RNA-seq检测，通过对RNA-seq检测结果的生物信息学分析，发现了G6PD对苯毒性调控相关的主要通路为谷胱甘肽代谢通路、磷酸戊糖通路、氧化应激、凋亡、代谢、造血谱系等。进而研究GSH干预对G6PD调控1，4-苯醌毒性的影响，结果显示GSH干预能够降低1，4-BQ对G6PD低表达K562细胞株的氧化损伤，降低Pgk1、Pgd在G6PD低表达细胞和阴性对照细胞之间的mRNA差异变化水平，表明谷胱甘肽代谢通路是G6PD对苯毒性影响的重要通路之一。以上研究为G6PD对苯暴露小鼠骨髓细胞信号通路影响的研究提供了科学线索。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照

前言

第一章 应用RNA-seq研究G6PD缺陷对苯暴露小鼠骨髓细胞mRNA表达谱的影响

第一节 苯染毒G6PD低表达小鼠骨髓细胞mRNA的差异表达谱

第二节 RNA-seq检测结果的验证

第二章 G6PD对苯毒性调控的通路研究

第一节 G6PD低表达对小鼠骨髓细胞信号通路的影响

第二节 苯染毒对小鼠骨髓细胞信号通路的影响

第三节 G6PD低表达对苯染毒小鼠骨髓细胞信号通路的影响

第三章 GSH干预对G6PD调控1，4-苯醌毒性的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

总结

参考文献

综述 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷的研究进展

致谢

作者简介