维生素D代谢通路异常甲基化与结核病发病风险和预后的分子流行病学研究

摘要

背景与目的:结核病是一种慢性感染性疾病，其是由结核分枝杆菌引起的，目前结核病已成为全球性的公共卫生问题之一。感染结核杆菌后多数处于潜隐性感染状态，只有5-10％会进展为活动性结核病。维生素D的活性代谢物可以活化巨噬细胞，激活抗结核免疫反应，观察性研究显示维生素D缺乏与结核病发病风险增加有关，补充维生素D成为结核病辅助治疗手段之一，然而干预性研究却未能得出一致的结论。许多研究表明宿主遗传因素决定了结核分枝杆菌-宿主相互作用的结果。进一步研究发现，维生素D代谢通路中关键基因的遗传和表观遗传学改变可导致个体维生素D活性代谢产物的水平差异，并影响抗结核免疫能力。维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)和细胞色素P450家族(Cytochrome P450 proteins，CYP)基因启动子区的高甲基化可使相关基因表达沉默，影响维生素D的代谢水平，进而影响结核病的发病风险和预后，但相关研究还很匮乏。基于上述背景，本次研究选择参与维生素D代谢的多个关键基因，采用病例对照研究和前瞻性队列研究设计，同时利用现场流行病学调查方法，采用全启动子区测序技术进行甲基化分析，结合血清维生素D浓度检测，分析与结核病发病风险和预后有关的表观遗传生物标志物，研究结果将为结核病预防和控制提供依据。
　　方法:本研究包括两个部分，第一部分是维生素D及其代谢通路基因启动子区甲基化与结核病发病风险的关联研究。病例来源于2014～2016年从江苏连云港和镇江收集的新发肺结核病人，共122例。按年龄和性别与病例组进行频数匹配，选取118例参与社区健康体检的居民作为对照组。采集静脉血样用于检测血清25-羟基维生素D和1，25-二羟基维生素D浓度。选择维生素D代谢通路主要候选基因(VDR、CYP2R1、CYP24A1、CYP27A1、CYP27B1)，采用高通量二代测序方法检测各CG位点的甲基化，结合目的区域富集技术和生物信息数据分析，绘制DNA甲基化图谱。关联强度采用非条件logistic回归模型计算优势比(Odds Ratio，OR)及其95％可信区间(Confidence Interval，CI)表示。第二部分是维生素D及其代谢通路基因启动子区甲基化与结核病预后的关联研究，随访上述结核病例的治疗结局，分析血清25-羟基维生素D和1，25-二羟基维生素D浓度及其相关基因甲基化与治疗结局的关联，采用Kaplan-Meier法估计不同时点的痰菌阴转率并绘制生存曲线。用Spearman等级相关分析计算维生素D浓度与甲基化的关联。甲基化程度采用单位点和多位点累积联合分析法。检验水准为0.05。
　　结果:(1)病例组基线血清25-羟维生素D浓度为（51.60±27.25）nmol/L，对照组血清25-羟维生素D浓度为（117.50±75.50）nmol/L，两组间差异具有统计学意义(Z=-8.515，P＜0.001)。病例组基线血清1，25-二羟基维生素D浓度为82.63±51.43pmol/L，明显低于对照组（94.02±49.26pmol/L），差异有统计学意义(Z=-2.165，P=0.03)。病例组强化治疗期结束血清中1，25-二羟基维生素D浓度为70.81±44.50pmol/L，低于治疗前，两者差异有统计学意义（Z=-2.606，P=0.009）。单位点分析经Bonferroni校正后显示55个CpG位点甲基化水平在病例和对照的间差异有统计学意义，其中CYP27B1基因41.5％的CpG为差异甲基化位点，CYP24A1基因上31.7％的CpG为差异甲基化位点，VDR基因14.7％的CpG为差异甲基化位点，CYP27A1基因12.3％的CpG为差异甲基化位点。多位点联合分析分别采用4种模型，模型一:纳入所有310个CpG位点;模型二:仅纳入167个差异甲基化CpG位点;模型三:在模型二的基础之上，排除病例组甲基化频率高于对照的CpG位点，仅分析164个关联方向一致的位点;模型四:纳入55个经Bonferroni校正后仍存在统计学意义的甲基化CpG位点。结果显示，所有模型中的CYP24A1、CYP27A1、CYP27B1和VDR累积甲基化率在病例与对照间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。受试者工作特征(Receiveroprating characteristic，ROC)曲线下面积(Area under curve，AUC):模型一AUC=0.747(95％ CI:0.685-0.809)，模型二AUC=0.805(95％ CI:0.749-0.860),模型三AUC=0.838(95％ CI:0.789-0.888)，模型四AUC=0.810(95％ CI:0.754-0.866)。CYP24A1、CYP27A1、CYP27B1和VDR基因甲基化率与25-羟基维生素D浓度呈正相关(P＜0.05)。模型一和模型四中CYP27A1基因甲基化与1,25-二羟基维生素D之间的交互作用存在统计学意义(P＜0.05)。模型三中VDR和CYP2R1基因甲基化与1，25-二羟基维生素D之间的交互作用存在统计学意义(P＜0.05)。(2)结核病例随访研究显示，强化治疗期结束血清中1，25-二羟基维生素D浓度与患者治疗结局的关联有统计学意义（P=0.008）。血清1，25-二羟基维生素D浓度高，痰菌阴转率显升高(P=0.003)。比较治疗成功和失败者差异甲基化位点的分布，CYP24A1基因14.6％的CpG为差异甲基化位点，CYP27A1基因2.7％的CpG为差异甲基化位点，CYP27B1基因5.7％的CpG为差异甲基化位点，CYP2R1基因5.9％的CpG为差异甲基化位点，VDR基因10.7％的CpG为差异甲基化位点。CYP2R1基因甲基化率与强化治疗期结束25-羟基维生素D浓度间存在交互作用(P＜0.05)。
　　结论:血清维生素D浓度及其代谢通路上的CYP24A1、CYP27A1、CYP27B1、CYP2R1与VDR等基因的甲基化与结核病发病风险和预后有关。探讨维生素D代谢通路基因异常甲基化在结核病高危人群筛选和预后中的作用对于结核病防制工作具有积极意义。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 维生素D及其代谢通路基因启动子区甲基化与结核病发病风险的关联研究

一、对象与方法

二、结果

三、讨论与结论

第二部分 维生素D及其代谢通路基因启动子区甲基化与结核病预后的关联研究

一、对象与方法

二、结果

三、讨论与结论

总结

参考文献

文献综述 维生素D与呼吸道疾病的研究进展

附录一、常用名词缩略语

附录二、硕士期间发表文章

致谢