利用飞行时间质谱简便、快速鉴定蓝藻新方法的研究和应用

摘要

水体富营养化与其引发的蓝藻水华现象以及产生的藻毒素问题，对我国的水环境产生了长期不良的影响与危害，是目前仍旧面临的一个难题。在采取治理措施的同时，必须对发生蓝藻水华的水体进行即时监测，并对其发生的可能性提前做出预警，从而制定及时有效的治理手段。目前，尽管国内外针对富营养化湖泊中蓝藻水华的监测已经开发了多种方法，但是仍缺乏快速、简便和精确的监测方法。本研究建立了以核糖体蛋白质为生物标识物，以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为测试手段的鉴别蓝藻新方法，并探讨其在蓝藻毒性鉴别与蓝藻多样性分析的应用以及在监测方面应用的可能性。
　　首先，本研究通过对蓝藻样品三种前处理方法的筛选，探讨使蓝藻样品的核糖体亚基蛋白质在合适的范围内被检测到并且信号达到最强，以及利用蛋白质组学分析核糖体蛋白质作为鉴别蓝藻的生物标识物的可行性。结果表明，采用机械破碎和高速离心的前处理可获得铜绿微囊藻标准株（Microcystis aeruginosa，NIES-843）的核糖体亚单位，通过对核糖体亚单位进行MALDI-TOF MS测定并与其理论计算值进行比较，全部52个核糖体蛋白质中有31个能够被成功地检测到，其中高频度且高强度出现的13个核糖体蛋白质（L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20和S14）被选作鉴别蓝藻的特征生物标识物。
　　以建立的测定方法，对55株来自不同采集环境的M.aeruginosa进行测定和蛋白质组学分析，同时利用非加权组平均法(UPGMA)绘制出系统分类树，对其进行种内基因多样性分析。结果表明，不同M.aeruginosa株的同种核糖体蛋白质间存在不同类型(type);55株M.aeruginosa通过UPGMA分析被分为5个主要分支(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ)，其中，有毒藻藻株被分类至Ⅰ组和Ⅱ组，而无毒藻株则被分至Ⅲ-Ⅴ组。此结果表明利用核糖体蛋白质为生物标识物的MALDI-TOF MS鉴别法可以实现在株水平上对蓝藻的鉴别并可对有毒和无毒的藻株进行有效区分。
　　为了探讨所建立的MALDI-TOF MS法在实际水体中鉴别蓝藻的可行性，先通过测定一系列不同细胞密度的M.aeruginosa NIES-843样品，确定该方法的敏感性及实际应用中样品体积的合理性，再通过测定4种不同种类的蓝藻在不同浓度下的模拟实际水体而配成的人工混合样品，确定该方法从混合物中检测出目标M.aeruginosa的可行性。结果表明:MALDI-TOF MS法的最小生物量检出限为1.955×106cells，特征核糖体蛋白质检出11个，检出率为84.6％，与此相对应的有蓝藻水华发生的湖泊水体采样体积为0.1-1L，在日常水质监测中属于合理的采样体积;同时，MALDI-TOF MS法对四种不同种属的蓝藻配成的人工混合样品的测定，证明了铜绿微囊藻NIES-843可以被有效地检测出，最低生物量检出限为2.88×106cells，相对应的混合样品3中M.aeruginosa的占比为37％，特征核糖体蛋白质的检出率为76.9％。
　　最后，将基于13个特征核糖体蛋白质为生物标识物的MALDI-TOF MS法对采集于太湖夏季的四个不同地点的实际水样进行检测分析。结果表明，实际太湖样品1和4中能检测出9个特征标识峰，检出率为69.2％，太湖样品2和3中则能检测出11个特征标识峰，检出率为84.6％;同时，来自太湖的实际水样中同种核糖体蛋白质的不同类型也被检测到(L32，L35，L29，L28和S14)，即在太湖不同地点存在不同株型的铜绿微囊藻，揭示了株水平上的多样性。
　　综上所述，本研究所建立的新方法可简便、快速、高精度地鉴别蓝藻的优势种铜绿微囊藻，并可望实现用于实际湖泊水体中蓝藻的鉴别与监测的目的。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 水体富营养化的现状

1．1．2 对蓝藻进行监测的必要性和重要性

1．1．3 现有监测蓝藻的方法及不足

1．2 引入MALDI-TOF MS法

1．2．2 MALDI-TOF-MS鉴别微生物的原理

1．2．3 生物标识物的选择

1．2．4 以核糖体蛋白质为生物标识物的MALDI-TOF MS法鉴别微生物的的优势

1．3 研究内容

1．3．4 MALDI-TOF-MS鉴别太湖实际样品中蓝藻的应用

1．4 研究目的及意义

1．5 技术路线与实验流程

1．5．1 技术路线

1．5．2 操作流程图

1．6 特色与创新

第二章 MALDI-TOF MS检测蓝藻新方法的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 藻株信息

2．1．2 试剂与仪器

2．1．3 三种前处理制备方法

2．1．4 基质辅助激光解吸电离平衡飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)及优化条件

2．2 三种前处理方法的筛选

2．3 M．aeruginosa NIES-843的核糖体蛋白峰值的鉴定

2．4 本章小结

第三章 MALDI-TOF MS对M．aeruginosa的遗传多样性分析研究

3．1 材料与方法

3．1．1 藻株信息

3．1．2 试剂与仪器

3．2 对M．aeruginosa不同株型的鉴定

3．3 不同M．aeruginosa株的遗传多样性分析

3．4 本章小结

第四章 MALDI-TOF MS对人工混合样品的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 藻株信息

4．1．2 培养基信息

4．1．3 试剂与仪器

4．1．4 M．aeruginosa NIES-843的稀释方法

4．1．5 藻株混合方法

4．2．1 稀释样品中核糖体蛋白生物标识物的峰值

4．2．2 稀释样品中标识峰值误差分析

4．2．3 稀释样品中标识峰值强度分析

4．2．4 稀释样品中NIES-843的检出限分析

4．3 MALDI-TOF MS对混合样中不同种类蓝藻的检测

4．4 MALDI-TOF MS对于混合蓝藻样品的分析

4．4．1 混合样品中核糖体蛋白生物标识物的峰值

4．4．2 混合样品中标识峰值误差分析

4．4．3 混合样品中标识峰相对强度分析

4．4．4 混合样品中NIES-843检出限分析

4．5 本章小结

第五章 MALDI-TOF MS法对于测定太湖实际蓝藻样品的应用

5．1 材料与方法

5．1．1 样品信息

5．1．2 试剂和仪器

5．2．1 太湖实际蓝藻样品中核糖体蛋白生物标识物的峰值

5．2．2 太湖实际混合蓝藻样品中标识峰值的误差分析

5．2．3 太湖实际混合蓝藻样品中标识峰值的强度分析

5．3 太湖蓝藻样品的多样性分析

5．4 本章小结

第六章 讨论与展望

参考文献

致谢

硕士期间发表论文