单细胞WGS和RNa-seq在癌症演化研究中的应用

摘要

癌症是人类健康的重要威胁之一。据估计，仅在2015年一年中，中国有大约429万人被确诊患有癌症，同时，有大约281万人死于癌症。随着对癌症的深入研究，除了常规的放疗和化疗，针对不同癌症的靶向治疗和免疫治疗的治疗手段也在不断发展。然而，癌细胞具有极强的突变和适应能力。通过治疗，癌症虽然会出现一定程度的缓解，但是随后往往会出现复发和转移，使得癌症治疗更加困难。
　　癌症的发生、发展和转移/复发是一个动态的演化历程，而慢性淋巴系白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL)则是一个很好的研究对象。CLL是一种最常见的血液系统恶性肿瘤，多起源于一群恶性增殖的B淋巴细胞。由于CLL的发展较缓慢，大部分CLL病人在确诊的前几年并不需要进行治疗。同时，抽血就可以获取癌细胞，可以实现对癌症的长期监控。随着测序成本的降低，研究人员对大量的癌症进行了全基因组测序以及RNA-seq测序。通过大规模的测序研究，研究人员发现多个与CLL相关的突变以及信号通路，并基于突变信息推断CLL的演化历程。然而，基于单个或少量时间点的组织样本的测序信息，并不能准确的回溯癌症的演化历程。因此，本论文针对以上问题，以一例CLL病人为研究对象，对多个时间点的癌症样本进行组织水平和/或单细胞水平的测序分析，重构出这例CLL的演化历程，揭示了CLL发展过程中重要突变。论文的具体研究内容为:
　　1.研究对象为一例有29年跟踪历史的CLL，选取其确诊后第8年至第28年间的16个时间点的冻存血液样本，通过流式细胞荧光分析仪进行分选，获得癌细胞。对不同时间点的癌症样本进行组织水平的全基因组测序、芯片测序、单细胞低深度全基因组测序以及单细胞转录组测序，获得合格的测序原始数据。
　　2.对组织水平的全基因组测序和芯片测序结果进行分析，获得第8年至第28年间癌症样本中的拷贝数变异信息（Copy Number Variations，CNVs）。结合病人的治疗信息以及单细胞全基因测序结果可知，在治疗前，CLL主要以染色体13q14缺失、6q缺失和12q增加为主。随着治疗的进行，这些CNVs逐渐消失，取而代之的是另一个带有12号染色体三倍型和10p中性杂合性缺失的细胞克隆，并一直维持到第28年。同时，通过全基因组测序结果，在已知的CLL的重要基因MYD88上检测到非同义突变。
　　3.对其中5个时间点共300个单细胞RNA-seq数据进行分析，发现多个与干细胞调控相关的转录调控因子的异常表达，包括FOS，JUN和KLF4等基因。在进行第二次治疗后，癌细胞呈现出另外一种完全不同的表达模式，而且细胞之间的差异性更大。而在一段短暂的缓解期内，癌细胞则表现的与早期细胞相似。除此之外，伪时间演化分析也进一步揭示了癌症在发生、恶化、缓解和复发等不同阶段中基因表达水平的复杂变化。多个癌症相关的重要细胞通路，如B cell receptor通路、EGFR通路、ERKs通路和NF-kappa B通路等，都在CLL的发展历程中表现出表达水平的变化。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 测序技术的发展

1．2．1 第二代测序技术的发展

1．2．2 文库制备和生物信息分析技术的发展

1．3 单细胞测序技术的发展

1．3．1 单细胞DNA和RNA的扩增技术

1．3．2 单细胞测序技术在癌症研究中的应用

1．4 癌症演化的研究

1．4．1 驱动突变和克隆细胞系

1．4．2 癌症演化的影响因素

1．5 慢性淋巴性白血病的研究

1．6 论文的主要研究内容

第二章 样本的准备及测序

2．1 引言

2．2 样本临床信息

2．3 淋巴细胞分选

2．3．1 实验试剂与仪器

2．3．2 流式细胞分选

2．4 样本准备和测序

2．4．1 多细胞样本DNA提取和SNP array分析

2．4．2 多细胞样本DNA提取、建库和测序

2．4．3 单细胞分选、DNA扩增、建库和测序

2．4．4 单细胞分选、RNA扩增、建库和测序

2．5 本章小结

第三章 多细胞样本数据的生物信息分析

3．1 引言

3．2 SNP array数据分析

3．2．1 CNV检测

3．2．2 CNV结果分析

3．3 多细胞WGS数据分析

3．3．1 CNV分析

3．3．2 SNP分析

3．4 本章小结

第四章 单细胞数据的生物信息分析

4．1 引言

4．2 单细胞WGS分析

4．2．1 CNV检测

4．2．2 样本过滤

4．2．3 CNV分析

4．3 单细胞RNA-seq分析

4．3．1 测序数据处理

4．3．2 单细胞样本和基因过滤

4．3．3 层次聚类分析

4．3．4 伪时间演化分析

4．3．5 可变剪切和融合基因分析

4．4 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 论文的主要研究内容和研究成果

5．2 下一步工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文清单