玉米DNA诱导的水稻变异株系RMIM91 WGS及RNA-Seq分析

摘要

外源DNA导入是创造新种质、培育新品种的一种新途径，通过将外源DNA导入到植物种质系统的细胞，获得突变材料，并筛选出具有某些目的性状的新种质和新品种。
　　本实验室利用改良的“花粉管介导法”，将玉米DNA导入水稻“日本晴”，获得了一批突变株，经多代自交选育，至第八代选育出与日本晴农艺性状有明显差异的基本稳定遗传的变异株系，命名为RMIM91（以下简称R91）。对R91进行全基因组重测序、转录组测序、蛋白结构预测和激素信号传导通路分析，结果表明:1、基因组测序结果中检测到大量突变位点，与水稻数据库和对照基因组数据比对后，筛选获得R91特有突变位点共200，479处，包括103，314处SNP和97，165处InDel，说明外源DNA对水稻基因组DNA诱变效果明显。2、R91特有SNP突变中发生碱基转换有62，647处，碱基颠换有40，667处，InDel突变包括61，816处插入和35，348处缺失，说明R91中转换频率大于颠换频率，插入突变多于缺失突变。3、R91基因组碱基发生突变的频率由高到低为:G(30.76％)＞C(30.28％)＞A(19.59％)＞T(19.37％)，说明在R91中G和C是易突变碱基。4、SNP突变位点中，临侧碱基为PuNPu的突变位点有26，453处，为PyNPy的突变位点共有26，314处，临侧碱基为PuNPy&PyNPu的位点共有50，545处，其中临侧碱基为CNG的突变位点有8，610处，突变频率最高，表明在临侧碱基为C和G时碱基更容易发生突变。5、SNP突变发生在基因关键位点的共43处（基因启动子缺失突变1处、终止子突变17处、剪接区突变4处），有5处突变位点在R91下代基因组中重新检出。已知功能基因及上下游共检测到34处SNP突变，分别位于10个基因上，有4处影响蛋白编码，其中2处突变位点在R91下代基因组中重新检出。这表明全基因组测序检出的突变位点在R91中确实存在，外源DNA导入能诱导水稻基因组发生SNP突变。6、位于基因关键位点的InDel突变有986处，其中插入有613处，缺失374处;插入和缺失碱基变化范围主要分布在-2～2个碱基，说明InDel突变主要为3碱基以下的插入和缺失。7、从InDel突变中筛选出25个InDel位点进行检测，有14个突变位点在R91下代被重新检测到;已知功能基因及上下游的InDe突变位点有53处，共影响到18个基因，经检测有6处突变位点在R91下代重新检出。这表明外源DNA导入能诱导水稻产生InDel突变。8、R91下代扬花期剑叶和茎节的转录组数据分析表明，部分突变基因的表达水平较日本晴有显著变化:R91中被沉默的基因有Os06g0240400和Os12g0116200，被激活表达的基因有Os05g0309000和Os06g0246200;Os01g0686200基因在茎节和剑叶表达水平均上调，Os09g0567000基因在茎节和剑叶表达水平均下调，Os05g0390500和Os08g0193300基因仅在茎节表达上调，Os05g0309000仅剑叶表达上调，Os10g0126500基因仅茎节表达下调。表明外源DNA导入诱发的突变可以影响水稻基因扬花期的表达水平。9、蛋白结构预测分析结果表明，27处重检出的突变位点中，有7处破坏了蛋白的功能结构，说明外源DNA导入引起的突变可以对蛋白功能造成较大影响。10、功能富集聚类分析中，乙烯和脱落酸信号传导通路中部分基因表达水平差异显著，表明外源DNA导入诱发的突变对这两个激素信号传导通路有影响。
　　以上结果表明，外源DNA导入是一种有效的生物诱变技术，可以诱导水稻基因组发生大量SNP突变和插入缺失突变，以及少部分外源DNA序列的插入，改变水稻的基因序列，对基因编码的蛋白结构和功能以及基因表达水平有重大影响。研究中发现的易突变碱基和易突变位点，为研究水稻基因突变的分子机理提供理论依据;诱变引发的多种突变性状，对新基因发掘和功能基因研究、新种质资源的创制和利用有重要意义。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 水稻种质创制概述

1．1．1 杂交育种

1．1．2 分子育种

1．2 第二代测序及数据分析

1．2．1 全基因组重测序

1．2．2 转录组测序

1．2．3 生物信息学分析

1．3 论文研究的内容和意义

1．4 创新点

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验仪器及实验试剂

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要实验试剂

2．3 实验方法

2．3．1 基因组DNA提取

2．3．2 DNA质量检测

2．3．3 提取DNA分装

2．3．4 突变位点检测

2．4 基因组和转录组测序分析

2．4．1 基因组测序

2．4．2 转录组测序

2．4．3 数据分析

2．5 蛋白结构预测分析

2．6 激素信号转导通路分析

第三章 结果与分析

3．1 R91变异株系遗传性状

3．2 全基因组重测序

3．2．1 全基因组重测序质量

3．2．2 重测序结果与参考基因组比对

3．3 R91特有SNP突变分析

3．3．1 SNP突变位点在水稻染色体分布

3．3．2 SNP突变碱基置换类型

3．3．3 SNP突变位点临侧碱基

3．3．4 基因关键位点SNP突变

3．3．5 部分SNP突变检测

3．3．6 已知功能基因及上下游SNP突变

3．3．7 已知功能基因及上下游SNP突变检测

3．4 R91特有InDel突变分析

3．4．1 R91特有InDel突变位点在水稻染色体上分布

3．4．2 基因关键位点InDel突变的碱基数目

3．4．3 基因关键位点InDel突变类型

3．4．4 部分InDel突变检测

3．4．5 已知功能基因及上下游InDel突变

3．4．6 已知功能基因及上下游InDel突变检测

3．5 转录组测序分析

3．5．1 转录组测序数据质量分析

3．5．2 R91与日本晴相关性检验

3．5．3 突变位点对基因表达的影响

3．6 蛋白结构和功能预测分析

3．6．1 Os01g0686200基因编码蛋白分析

3．6．2 Os05g0309000基因编码蛋白分析

3．7 R91乙烯和脱落酸激素信号转导通路分析

第四章 讨论

4．1 R91基因组突变分析

4．2 R91基因表达变化分析

4．3 R91中突变基因编码蛋白功能分析

4．4 R91中乙烯和脱落酸激素信号传递通路变化

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

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