多光子显微成像技术用于结直肠黏膜病变实时诊断的初步研究

摘要

背景： 结直肠癌作为全球常见的消化道肿瘤之一，其发病率及死亡率逐年升高。结直肠癌前病变及早期癌症的精准诊断是提高预后的关键。虽然各种各样内镜技术的发展大大提高了内镜下直视诊断的准确率，但是活检组织病理学检查仍是金标准。然而该过程周期较长、步骤繁琐，同时，临床活检存在出血、穿孔、转移等潜在风险，更重要的是，活检部位的选择取决于内镜医师的经验判断，取样误差、反复取样等问题亦亟待解决。因此，发现及建立深入细胞水平、媲美组织病理学结果的实时无损的新型成像技术是今后内镜诊断道路上的重要目标之一。 多光子显微成像技术（Multiphoton microscopic imaging，MPM）作为一种新型的非线性光学技术，其不借助于外在荧光标记，通过组织细胞的内在荧光物质产生的自体荧光信号及胶原组织产生的二次谐波效应，不仅可以捕获细胞形态和组织结构，还可以获得间质微环境中胶原的变化，实现无损、实时、精准的“光学病理”诊断。细胞产生的自体荧光主要来自于细胞胞质的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）。同时，多光子显微成像技术分辨率高，穿透深度深，可实现定量分析等。随着多光子显微镜的小型化发展，与结肠镜相结合后，未来有望成为新一代的光学诊断技术。 目的： 1.探索并建立出人体结直肠组织多光子成像的组织结构的诊断特征； 2.探索并总结出人体结直肠组织多光子成像的间质微环境信息的诊断要点； 3.运用以上归纳出来的结直肠组织的成像特点，扩大样本量，检测MPM的诊断效能，评估其在监测结直肠腺癌发展进程的应用潜能。 方法： 1.摘取SD大鼠的全层结直肠组织并利用其确定多光子显像技术的成像参数，优化活检组织样本的保存处理条件； 2.收集人体正常、增生性息肉、上皮内瘤变和癌变的结直肠组织样本进行离体MPM成像，根据双光子激发荧光（Two-photon excited fluorescence，TPEF）和二次谐波（Second harmonic generation，SHG）信号获得相应的TPEF和SHG图片。通过与病理切片图片的对比，进行相关诊断特征的建立，并且通过定量分析探讨组织结构及微环境变化。 3.扩大样本量，用以上总结出的MPM成像特点，以病理为金标准，计算MPM的诊断效能。 结果： 1.在最适实验条件下，本研究成功地从隐窝开口、腺体结构、腺上皮细胞这三个方面总结出人体结直肠正常组织、增生性组织、上皮内瘤变和腺癌多光子成像的组织学特征。通过细胞层面的定量分析证明了正常组和增生性息肉的细胞核面积差异无明显统计学意义，但是均明显小于上皮内瘤变及腺癌的腺上皮细胞核面积；正常、增生性息肉和腺癌的腺上皮细胞核形态趋向圆润，而上皮内瘤变的细胞核明显拉长，差异具有统计学意义。 2.通过识别SHG信号，本研究成功从胶原层面区分出人体结直肠正常组织、增生性组织、上皮内瘤变和腺癌。通过定量分析显示正常组织和增生性息肉的胶原信号较强，面积大而密集，而在腺癌组织中均明显减少，分散，差异具有统计学意义； 3.初步得出MPM技术的诊断效能为：正常组织：敏感度90.00％，特异度97.89％，准确性96.25%；增生性息肉：敏感度82.61％，特异度95.36％，准确性92.92%；上皮内瘤变：敏感度88.10％，特异度94.23％，准确性92.08%；腺癌：敏感度91.67％，特异度96.67％，准确性95.42%。 结论： 1.MPM可以定性、定量地从组织结构、间质中的胶原信息来区分人体正常结直肠组织、增生性组织、上皮内瘤变和腺癌； 2.MPM的诊断效能比较高，可实现无损、实时诊断，具有可观的发展前景。

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