IFN-α和IL-4联合GM-CSF诱导人树突状细胞表型及功能的比较研究

摘要

免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的一种新的肿瘤治疗模式。其中，肿瘤疫苗的主动性免疫是免疫治疗的重要方法之一，近年来，国内外都加强了肿瘤疫苗的研制，但进展较缓慢，主要原因在于疫苗进入患者体内难以有效激活抗原特异性T细胞，如何解决这一问题成为肿瘤疫苗研制的难点。
　　肿瘤治疗性疫苗进入患者体内后有效激活抗原特异性T细胞需要被抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)有效呈递。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前功能最强的APC，可以摄取、加工处理外源性抗原并以抗原多肽-主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ， MHCⅡ）分子复合物的形式呈递给CD4+T细胞，激活Th1、Th2效应性T细胞，从而产生免疫应答。此外，DC也可以将抗原多肽-MHCⅠ类分子复合物呈递给CD8+T细胞，激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)介导的免疫应答，从而发挥清除病原菌、杀灭肿瘤的作用。体外通过IFN-α联合GM-CSF诱导人外周血单核细胞分化产生的干扰素-树突状细胞(IFN-DC)和IL-4联合GM-CSF诱导产生的白介素4-树突状细胞(IL-4-DC)是免疫治疗常用的方法，但是，其形态、功能尚需进一步比较以明确哪种DC用于免疫治疗更为有效。
　　富含短寿蛋白的自噬小体（DRips in blebs，简称DRibbles）是包含多种肿瘤细胞抗原的囊泡，其主要成分为自噬小体。既往研究发现DRibbles能够在小鼠体内高效的交叉激活肿瘤抗原特异性CTL，并能在体外激活人病毒抗原特异性CTL。DRibbles是否能够在人体内激活抗原特异性T细胞尚未可知。
　　本研究通过体外诱导单核细胞生成了IFN-DC和IL-4-DC，比较了两种DC的形态、表型、功能，选取交叉递呈功能更强的IFN-DC作为APC，将其与肝癌细胞来源的DRibbles联合注射入肝癌患者体内，并检测患者体内抗原特异性T细胞的激活。本研究的开展有助于研发基于DC及DRibbles的肿瘤免疫治疗方案。
　　目的:1.通过体外培养IFN-DC和IL-4-DC，研究两种细胞在形态学、表型、分泌细胞因子及交叉递呈功能上的区别，为DC疫苗用于肿瘤患者的免疫治疗奠定基础。2.初步研究IFN-DC联合肝癌疫苗在肝癌患者体内激活抗原特异性T细胞应答的作用。
　　方法:1.在体外分别用细胞因子GM-CSF联合IFN-α或者GM-CSF联合IL-4诱导培养人外周血单核细胞为IFN-DC或IL-4-DC，随后加入TNF-α促进DC成熟，通过光镜和电镜观察两种DC的形态，流式细胞术检测两种DC的表型，ELISA法测定两种DC分泌的细胞因子含量(IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-18、IL-23);随后将两种DC分别负载CMVpp65蛋白后与自体T淋巴细胞共培养，通过细胞内染色方法检测T细胞分泌IFN-γ的情况。2.入组6例原发性肝癌患者。方法同上获取患者PBMC及培养IFN-DC，将IFN-DC皮下注射，同时在彩超引导下行双侧腹股沟淋巴结注射SMMC7721-DRibbles;1月后，IFN-DC体外负载SMMC7721-DRibbles，在患者双侧腹股沟淋巴结区域皮下注射。采集患者治疗前及治疗后的PBMC，通过流式细胞术检测患者PBMC中T细胞亚群比例、ELISPOT及胞内染色方法检测患者PBMC中抗原特异性T细胞比例。
　　结果:1.IFN-DC和IL-4-DC均具有典型的树突状细胞形态，成熟的IFN-DC的突起较短且粗，而成熟的IL-4-DC的突起较长且细;同时成熟的IFN-DC比成熟的IL-4-DC含有更多的细胞器，而成熟的IL-4-DC包含更多的细胞空泡。2.单核细胞低表达HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86，未成熟DC中度表达CD80、CD83、CD86，成熟型DC表达HLA-DR、CD80、CD86及CD83均上调;与IL-4-DC相比，IFN-DC表达更高水平的CD80、CD83、CD86，HLA-DR的表达水平类似，成熟IFN-DC表达CD11c的水平低于成熟IL-4-DC。3.两种DC未成熟状态下分泌少量的细胞因子（IL-10、IL-1β、IL-18、IL-12p70、IL-23），促成熟后，两种DC均能分泌大量细胞因子;成熟的IFN-DC分泌的细胞因子IL-10、IL-1β、IL-18、IL-12p70高于成熟的IL-4-DC，IL-23相差不明显。4.负载CMVpp65蛋白的不成熟IFN-DC及不成熟IL-4-DC能够分别诱导(0.28±0.07)％及（0.12±0.02）％的自体CD8+T细胞激活(P＜0.05);成熟IFN-DC及成熟IL-4-DC能够分别激活（1.03±0.21）％及（0.35±0.14）％的自体CD8+T细胞(P＜0.05)。5.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗较安全，无严重不良反应。6.与治疗前相比，IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗后患者CD3+T细胞占PBMC的比例无明显变化（60.5±9.9％ VS60.5±7.9％，P＞0.05），CD3+CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例下降（58.9±7.1％ VS53.3±2.6％，P＜0.05），CD3+CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例上升(28.7±5.9％ VS35.7+5.6％，P＜0.05)，CD3+CD56+ NKT细胞比例无明显变化(5.6±2.6％ VS6.1±3.3％，P＞0.05)。7.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗能够诱导原发性肝癌患者体内肝癌抗原特异性T细胞激活。
　　结论:1.IFN-DC和IL-4-DC在形态、表型和功能上均有不同。与IL-4-DC相比，IFN-DC能够表达更高水平的CD80、CD83、CD86，分泌更多的细胞因子，负载CMVpp65蛋白能够更有效激活人抗原特异性CD8+T细胞。因此，IFN-DC用于肿瘤的免疫治疗可能比IL-4-DC更有效。2.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗肝癌患者安全，能够诱导患者体内抗原特异性T细胞的激活。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

前言

参考文献

文献综述 体外培养DC研究现状

第一部分 IFN-DC与IL-4-DC的形态、表型及功能比较

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

参考文献

第二部分 IFN-DC联合肝癌疫苗激活原发性肝癌患者体内T细胞应答的初步研究

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

结论

致谢

作者简介