第三代LMP1 CAR-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用研究

摘要

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤，常因病灶复发和头颈部淋巴结转移而影响患者生存质量。目前放疗为鼻咽癌治疗的首选，但是由于鼻咽癌早期症状并不典型，患者往往错过治疗的最佳阶段，彻底清除鼻咽癌细胞存在较大困难。以T细胞过继治疗为基础发展而来的嵌合抗原受体（chimeric antigenreceptor，CAR）T细胞治疗技术因其特有的靶向性，特异性杀伤肿瘤细胞成为肿瘤免疫治疗的“新贵”。目前，以CD19为标靶的代表性CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤（特别是B细胞前体急性淋巴细胞白血病）取得明显的疗效，并被美国FDA批准上市。虽有CD19CAR-T细胞顺利治愈复发性脑胶质瘤的个案，然而大部分实体瘤缺少特异性靶标和体内免疫逃逸机制，始终是CAR-T细胞应用于实体瘤必须攻克的两大难点。研究表明，鼻咽癌可由EB病毒感染所致。EB病毒介导鼻咽上皮细胞非极化，通过对EMT通路的调控诱导鼻咽部上皮细胞的转化，干扰正常鼻粘膜细胞的生理功能，促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并且抑制其凋亡。EB病毒潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1，LMP1）在鼻咽癌细胞的广泛表达，而在正常组织中基本不表达，使其成为最佳的诊断和治疗的靶点。本研究在利用抗体库技术制备全人源LMP1抗体的基础上，通过构建第三代LMP1CAR慢病毒表达载体，制备第三代LMP1CAR-T细胞，证实其在体内外对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，为鼻咽癌免疫治疗临床研究提供坚实的基础。 研究目的： 1.制备针对LMP1基因的第三代CAR-T细胞 2.优化LMP1CAR-T细胞的增殖、分化与表达效率 3.探讨LMP1CAR-T细胞在体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用 研究方法： 1.以实验室早期制备保存的高亲和力的全人源LMP1Fab为模板，设计引物合成LMP1scFv的重轻链，利用overlap PCR构建LMP1的scFv段，利用基因工程技术将LMP1scFv段与含有CD8α，CD28，CD137，CD3ζ的慢病毒载体重组，制备第三代LMP1CAR慢病毒表达载体，PCR法与测序用于验证所构建的LMP1CAR慢病毒表达载体的正确性。 2.LMP1CAR慢病毒表达载体由转染试剂PEI转染到X-293T细胞，以CD3ζ抗体为一抗，Western blot法检测LMP1CAR在X-293T细胞中的表达。 3.应用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离健康志愿者外周血，提取PBMC，经CD3、CD28抗体激活，IL-2刺激扩增，获得足够量的T细胞。LMP1CAR病毒包装产物感染T细胞制备LMP1CAR-T细胞。 4.培养鼻咽癌细胞（CNE1、CNE2、HONE1、C666-1与SUNE1），流式细胞术与Western blot法检测鼻咽癌细胞表面LMP1的表达，分别筛选LMP1高表达，低表达以及不表达的鼻咽癌细胞株。 5.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1CAR-T细胞，共培养6h后，CCK8法检测效靶比20∶1、10∶1、5∶1、2∶1时，LMP1CAR-T细胞对鼻咽癌细胞（CNE1、CNE2、HONE1）的杀伤作用。T细胞与CD19CAR-T细胞设立为对照。 6.CCK8法检测LMP1CAR-T细胞在效靶比10∶1时对鼻咽癌细胞的杀伤作用。LMP1高表达淋巴瘤细胞株Raji设立为对照。 7.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1CAR-T细胞，共培养24h后，收集上清，ELISA法检测LMP1CAR-T细胞在鼻咽癌细胞刺激下，细胞因子（IL-2、IFN-γ）的分泌情况。T细胞与CD19CAR-T细胞设立为对照。 8.筛选Luciferase标记的LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1的稳定株。裸鼠单侧腋下注射CNE1细胞成瘤后，第0，3，6天瘤周注射CAR-T细胞，每次注射前进行活体成像，检测LMP1CAR-T细胞在体内对LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的增殖抑制作用。CD19CAR-T细胞，T细胞与生理盐水作为对照。 9.裸鼠双侧腋下注射鼻咽癌细胞，一侧为100%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1，另一侧为50%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1+50%LMP1阴性鼻咽癌细胞HONE1，成瘤后0，3，6天瘤周注射CAR-T细胞，分别于第0天与第9天进行活体成像，比较检测LMP1CAR-T细胞对LMP1阳性与LMP1阴性鼻咽癌移植瘤的杀伤效应。 研究结果： 1.成功制备第三代LMP1CAR慢病毒表达载体，PCR结果显示条带大小与理论值一致，基因测序结果显示制备的LMP1CAR序列正确。 2.Western blot检测CD3ζ的表达，条带大小与理论值一致，结果显示LMP1CAR慢病毒表达载体能在X-293T细胞中表达。 3.成功筛选出LMP1高表达鼻咽癌细胞株CNE1，LMP1低表达鼻咽癌细胞株CNE2与LMP1不表达鼻咽癌细胞株HONE1。 4.CCK8结果显示LMP1CAR-T细胞在效靶比20∶1与10∶1时对LMP1阳性的鼻咽癌细胞的杀伤作用与CD19CAR-T细胞与T细胞相比具有统计学差异(P＜0.05)。效靶比为10∶1时，LMP1CAR-T细胞对鼻咽癌细胞CNE1、CNE2的杀伤率分别为(66.51±4.06)%和(49.91±6.81)%，与CD19CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异(P＜0.05)。而LMP1CAR-T细胞对鼻咽癌细胞HONE1的杀伤率为(33.33±0.91)%，与CD19CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异(P＞0.05)。 5.ELISA结果表明，LMP1CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（1,962.58±54.65）pg/ml和（2,229.73±45.69）pg/ml；LMP1CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE2共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（550.86±98.64）pg/ml和（438.21±44.52）pg/ml，与CD19CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异(P＜0.05)。而LMP1CAR-T细胞与鼻咽癌细胞HONE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为（95.31±30.60）pg/ml和（201.50±20.47）pg/ml，与CD19CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异（P＞0.05）。LMP1阳性细胞能刺激LMP1CAR-T细胞释放IL-2与IFN-γ。 6.单侧活体成像结果显示LMP1CAR-T细胞在体内能抑制LMP1阳性鼻咽癌细胞移植瘤的增殖，与对照组具有统计学差异(P＜0.05)。 7.双侧活体成像结果显示LMP1CAR-T细胞显著特异性抑制LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的生长，而对LMP1阴性移植瘤无明显作用，与对照组具有统计学差异(P＜0.05)。 研究结论： 本研究成功构建第三代LMP1CAR慢病毒表达载体，制备第三代LMP1CAR-T细胞，并证实LMP1CAR-T细胞在体内外对LMP1阳性的鼻咽癌细胞具有增殖抑制作用。

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