罗格列酮对慢性温和不可预知应激所致小鼠抑郁症的治疗作用及机制

摘要

抑郁症(depression)是心境障碍的一种，其主要临床特征是心境低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退和躯体症状。据WHO最新的统计结果显示，全球抑郁症患病率高达12.8％，并预测2020年抑郁症将成为全球第二位医疗疾患。目前临床常用的抗抑郁药治疗作用有限，并且副作用明显。因此，寻求安全可靠且治疗效果显著的抗抑郁药迫在眉睫。
　　抑郁症患者中常出现前额叶-边缘系统的葡萄糖低代谢特征，提示能量代谢损伤可能都是抑郁症临床症状产生的神经生物学基础。除此之外，抑郁症和代谢性疾病还存在很多共同的病理特征，如血糖代谢失衡、慢性炎症反应、神经-内分泌紊乱等。因此，抑郁症与代谢性疾病有着十分密切的关系。
　　罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinedione，TZD)，临床上作为胰岛素增敏剂用于治疗2型糖尿病。越来越多的研究证实罗格列酮对包括脑卒中、阿尔茨海默病在内的多种神经精神类疾病具有神经保护作用。但是，罗格列酮在抑郁症中的作用及机制尚不清楚。本文从在体（慢性温和不可预知应激所致抑郁症模型小鼠）和离体（皮质酮诱导损伤的细胞模型）水平评价罗格列酮对抑郁症的潜在治疗作用及机制。研究结果将为抑郁症治疗提供新的思路和实验依据。
　　目的:
　　研究、阐明罗格列酮对抑郁症模型小鼠的实验性治疗作用及机制。
　　方法:
　　1.应用糖水偏爱测试(sucrose preference test，SPT)、强迫游泳(forcedswimming test，FST)和开场(open field test，OFT)等行为学实验，评价小鼠CMS模型及罗格列酮对抑郁样行为的影响。
　　2.免疫荧光技术(immunofluorescence，IF)检测前额叶皮层和海马石蜡切片中NeuN标记的神经元、神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)标记的星形胶质细胞和CD11b标记的小胶质细胞数量、形态及相关蛋白的表达情况。
　　3.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测动物血清中IL-6、TNFα、IGF1、VEGF、CNTF的浓度
　　4.培养原代皮层神经元、星形胶质细胞及N2a细胞系，应用免疫细胞化学(immuno cytochemistry，ICC)染色结合体视学技术，检测细胞阳性率。
　　5.用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)或者乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)法检测细胞活力。
　　6.透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察细胞自噬小体的形成及数量。
　　7.采用Annexin-Ⅴ和PI对星形胶质细胞进行双染，并用流式细胞分选仪检测原代星形胶质细胞的凋亡率。
　　8.应用免疫印迹法(western blotting，WB)检测动物组织及细胞样本中自噬相关蛋白LC3、AMPK、P62、ULK1及凋亡相关蛋白caspase3、Bax、Bcl-2、PARP的表达情况。
　　9.实时定量聚合酶链反应技术(real-time quantification polymerase chainreaction，RT-qPCR)检测细胞转染si-PPARγ的效率及细胞因子和STRAD、MO25的表达情况。
　　结果:
　　1.罗格列酮改善CMS引起的小鼠抑郁样行为
　　罗格列酮（5 mg/ml）能升高CMS模型小鼠的糖水偏爱率，并使其平均体重增加3.7 g;与CMS组小鼠相比，罗格列酮能显著增加小鼠在FST中的运动时间，延长小鼠在OFT中的中心停留时间。
　　2.罗格列酮能缓解CMS引起的前额叶皮层神经元和星形胶质细胞损伤，并增强海马区的神经再生能力
　　应用TUNEL染色显示，罗格列酮能减少皮层细胞的凋亡;通过免疫荧光实验发现，罗格列酮能够增加CMS小鼠前额叶皮层中星形胶质细胞的数量，并改善神经元轴突的密度。同时，罗格列酮增加海马CA1区中Ki67标记的新生神经元数目，表明罗格列酮具有改善抑郁症小鼠神经再生的作用。
　　3.罗格列酮能抑制小鼠体内的炎症反应，改善细胞因子分泌的紊乱
　　通过qPCR和ELISA实验发现，CMS造模导致小鼠血清和前额叶皮层中IL-1β、IL-6、TNFα的浓度及mRNA水平升高，而罗格列酮能逆转这些炎症因子的升高趋势;罗格列酮还能增加血清中CNTF和IGF1的浓度;使血清中皮质酮的浓度下降至366 ng/ml（CMS组为713 ng/ml）。
　　4.罗格列酮上调前额叶皮层神经元自噬水平并抑制凋亡
　　罗格列酮使自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、ULK1、Beclin1及p-AMPK/AMPK表达升高，而降低P62的表达。随后的免疫荧光实验发现，与CMS组相比，罗格列酮使NeuN标记阳性神经元中LC3B的表达升高约68％。另外，罗格列酮促进Bcl-2/Bax、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt和p-IRS1/IRS1等蛋白表达。
　　5.罗格列酮通过激活LKB1/AMPK通路，促进原代皮层神经元和N2a细胞的自噬
　　皮质酮(10μM)刺激导致原代皮层神经元和N2a细胞活力降低，而罗格利酮给药可以对抗皮质酮所致细胞的损伤。应用透射电镜观察结果显示，罗格列酮能增加自噬小体的形成;进一步对自噬相关蛋白ATG5、LC3、ULK1、P62等表达的分析表明，罗格列酮能逆转CMS引起的自噬水平降低。罗格列酮所引起的上述改变均可被PPARγ拮抗剂T0070907阻断;敲低和过表达PPARγ表达后，罗格列酮能明显降低或升高LKB1、STRAD、MO25的表达，从而影响罗格列酮对N2a细胞的神经保护作用。这些结果提示，罗格列酮作用于PPARγ、激活LKB1/AMPK通路，从而促进神经元自噬，产生神经保护作用。
　　6.罗格列酮通过增加IGF1R的表达、激活Akt/CREB通路，抑制皮质酮所致星形胶质细胞的损伤
　　应用流式细胞术检测AV/PI双染细胞、WB分析Bcl-2/Bax、caspase3、PARPp85等蛋白的表达，结果显示:罗格列酮具有抗凋亡作用。IGF1R在星形胶质细胞中表达明显高于神经元;罗格列酮增加IGF1R及其底物IRS1的磷酸化表达（分别增加约175％和86％），促进下游Akt、CREB的磷酸化，进而起到保护星形胶质细胞的做用。
　　7.罗格列酮改善皮质酮诱导的星形胶质细胞功能紊乱，进而保护皮层神经元
　　应用皮质酮和罗格列酮处理的星形胶质细胞所产生的条件培养基培养原代皮层神经元，结果显示条件培养基能对抗皮质酮所致神经元损伤、使细胞活力增加49％，同时细胞核皱缩的神经元数目显著减少。应用MAP2荧光探针标记条件培养基培养的神经元，发现条件培养基具有促进神经元轴突生长的作用。
　　结论:
　　罗格列酮通过促进神经元自噬、抑制星形胶质细胞凋亡，从而发挥抗抑郁效应。
　　本文工作的主要创新之处:
　　1.发现罗格列酮能减轻CMS和皮质酮所致神经元/星形胶质细胞损伤的作用，为将其发展为抑郁症药物提供了实验依据;
　　2.阐明罗格列酮通过激活LKB1/AMPK通路促进神经元自噬、激活Akt/CREB通路抑制星形胶质细胞凋亡，从而产生神经保护的作用机制。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

一、抑郁症的研究进展

二、抑郁症和糖尿病

三、罗格列酮与中枢神经系统疾病

四、本文研究工作的主要内容及意义

材料与方法

一、材料与方法

结果

2．罗格列酮缓解CMS诱导的前额叶皮层神经元／星形胶质细胞损伤和海马区神经再生的抑制

3．罗格列酮缓解抑郁症小鼠体内的炎症反应，并改善细胞因子分泌的紊乱

4．罗格列酮上调前额叶皮层中神经元自噬并抑制星形胶质细胞凋亡

5．罗格列酮通过增强自噬保护神经元

6．罗格列酮通过激活LKB1／AMPK通路，增强皮质酮作用下N2a细胞的自噬水平

7．罗格列酮通过上调IGF1R的表达和激活Akt／CREB通路而抑制皮质酮诱导的星形胶质细胞凋亡

8．罗格列酮改善皮质酮引起的星形胶质细胞功能，进而保护皮层神经元

讨论

结论

参考文献

综述 自噬在抑郁症中的研究进展

在读期间发表的研究论文及申请的专利

致谢