基于UPLC-MS/MS分析激素及其通路基因与男性结直肠癌遗传易感性的研究

摘要

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，结直肠癌的发病率在男性中位列所有肿瘤的第三位，在女性中位列所有肿瘤的第二位。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率均位列所有肿瘤的第五位，男性的发病率明显高于女性，性激素可能是一种重要的影响因素。由于人体内性激素水平痕量表达，因此其定量检测一直是难点，检测技术从免疫测定法、气相色谱串联质谱（gaschromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法逐步发展到了液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法。近年来，LC-MS/MS法由于其高灵敏度、高重复性和高准确性成为了性激素检测的主要方法，但仍存在一定的缺陷。现有研究表明，性激素水平与结直肠癌等多种肿瘤的发生发展相关，但其确切生物学机制并不明确。本文通过男性结直肠癌病例和对照人群血样，建立超高效液相色谱串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法以及运用生物信息学、基因遗传变异分型和一系列细胞表型实验进行如下研究：（1）基于UPLC-MS/MS分析激素与男性结直肠癌发病风险的研究；（2）激素通路基因遗传变异与男性结直肠癌易感性的研究。本研究有助于筛选结直肠癌病例对照中的差异激素作为结直肠癌易感的生物标志物，并揭示性激素通路基因遗传变异与结直肠癌发病风险的关系及其生物学机制。 第一部分 基于UPLC-MS/MS分析激素与男性结直肠癌发病风险的研究 目的：结直肠癌在男性和女性中的发病率有明显差异，且男性的发病率较高，性激素被认为是引起这种差异的一个重要影响因素，且已有相关报道显示性激素与结直肠癌等多种肿瘤的易感性相关，本文旨在筛选结直肠癌病例对照中的差异激素作为易感标志物。 方法：本研究收集了193例男性结直肠癌病例及203例男性正常对照作为研究对象，通过建立UPLC-MS/MS法同时检测结直肠癌病例对照血浆中三大类21种性激素的表达水平，并利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA）模型和非参数检验筛选结直肠癌病例对照中的差异激素。 结果：激素水平检测结果显示，检出率大于80%的激素有表雌三醇（16-epiestriol，16-epi-E3）、2-甲氧雌酮（2-methoxyestrone，2-MeO-E1）和4-甲氧雌酮（4-methoxyestrone，4-MeO-E1）。16-epi-E3在病例和对照中的检出率分别为88.5%和84.7%；2-MeO-E1的检出率分别为94.8%和97.5%；4-MeO-E1的检出率分别为86.4%和97.0%。根据PCA和OPLS-DA模型分析发现结直肠癌病例对照间的激素水平存在差异。OPLS-DA模型中导出各激素的变量投影重要性（variable importancein theprojection，VIP）值，并结合结直肠癌样本激素水平的非参数检验结果，发现2-MeO-E1的VIP＞1，P＜0.05。 结论：2-MeO-E1在结直肠癌病例对照组间的表达水平存在显著差异，可以作为结直肠癌发病风险的生物标志物，为结直肠癌的个体化预防、治疗提供依据。 第二部分 激素通路基因遗传变异与男性结直肠癌易感性的研究 目的：雌酮（estrone，E1）在CYP1A1和CYP1A2的催化下生成2-羟基雌酮（2-hydroxyestrone，2-OH-E1），2-OH-E1可与儿茶酚邻位甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）发生甲基化反应生成2-MeO-E1。已有研究表明性激素代谢通路上基因的遗传变异（以单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphisms，SNPs为主）与肿瘤的发病风险密切相关。本文旨在研究2-MeO-E1代谢通路上基因SNPs与结直肠癌易感性的关系并探索其生物学机制。 方法：本研究将2-MeO-E1代谢通路上的三个基因CYP1A1、CYP1A2、COMT作为候选基因，通过千人基因组计划项目筛选出候选SNPs，对688例男性结直肠癌病例及794例男性正常对照进行基因分型。采用多因素Logistic回归分析SNPs与结直肠癌易感性的关系。通过双荧光素酶报告基因实验以及细胞增殖、凋亡和周期实验研究SNPs对基因的表达调控的影响。 结果：COMT基因3’端非翻译区（3’-untranslated regions，3’-UTR）rs165599的G等位基因相比于A等位基因罹患结直肠癌的风险明显增加（调整OR=1.21，95%CI=1.05-1.40，P=0.009）。分层分析结果显示，与携带AA/AG基因型相比，携带GG基因型能够显著增加罹患结肠肿瘤、直肠肿瘤、中分化结直肠癌、高分化结直肠癌、Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌的风险（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验发现rs156699G等位基因能减弱miR-22-3p与COMT的结合能力，从而显著增加COMT的转录后表达。同时，在116对结直肠癌组织中发现COMT在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P=3.58×10-19），与TCGA中结果一致（P=1.36×10-10和P=2.04×10-6），且干扰COMT能抑制结直肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡和使细胞周期阻滞于G1期（P＜0.05）。 结论：COMT基因的rs165599A＞G突变能够显著减弱miR-22-3p与COMT的结合，从而增加COMT的表达，进而通过影响结直肠癌细胞的增殖、凋亡和周期促进结直肠癌的发生。

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