P2X7受体在胶质瘤发生发展中的作用及机制研究

摘要

胶质瘤是中枢神经系统发生率最高的恶性肿瘤,具有恶性增殖、侵袭性生长等生物学特性,总体治疗效果不佳.如何有效控制胶质瘤的恶性增殖和侵袭性生长是目前胶质瘤治疗的关键. 嘌呤系统被认为和许多肿瘤的发病有关,甚至是某些肿瘤的肿瘤标志物.嘌呤受体是中枢神经系统近年来研究颇多的一类受体,其中P2X7受体的研究广受关注.P2X7受体是ATP门控非选择性阳离子通道,当少量ATP激活,通道部分开放,仅通透Na+、K+、Ca2+等小阳离子,当长期过度激活可开放大孔径,导致大量钙离子及其他大粒子内流和激活细胞内第二信使,最终可导致细胞死亡.由于激活后胞内效应通路不同,P2X7受体既可能导致细胞死亡也可能维持细胞存活,因此起到双刃剑的作用. 激活P2X7受体是抗肿瘤还是促肿瘤发生一直存有争议.一些研究表明激活P2X7受体可诱导血管生成网络,提高VEGF活性,促进细胞侵袭和移行,具有促肿瘤生长的作用.然而,也有研究表明抑制P2X7受体可诱导肿瘤生长,激活P2X7受体可诱导肿瘤细胞死亡. 本课题利用免疫荧光组织化学、免疫荧光细胞化学、MTT实验、细胞划痕实验和Western blot等技术,研究了P2X7受体激活后胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡等生物学行为变化,并研究了其可能机制,分析了P2X7受体激活和肿瘤细胞生物学改变的关系.主要的结果如下: (1)我们选取不同分级胶质瘤患者的病理切片对P2X7受体进行荧光标记,发现肿瘤周围正常组织中的胶质细胞几乎不表达P2X7受体;我们在不同分级的胶质瘤细胞上均可检测到P2X7受体荧光表达,并且随着肿瘤分级的递增,P2X7受体荧光表达细胞阳性率呈增加的趋势. (2)为验证胶质瘤细胞株P2X7受体表达情况,我们在常用胶质瘤细胞株U87和U251进行荧光细胞染色,发现在U87和U251肿瘤细胞上均有P2X7受体表达. (3)我们利用P2X7受体特异性激动剂BzATP(100μM)作用于U87胶质瘤细胞,在6h,12h,24h和48h进行荧光免疫细胞化学染色和Western blot,发现随着BzATP作用时间延长,P2X7受体表达增加,BzATP对U251细胞系有相似的作用. (4)采用MTT方法检测胶质瘤细胞增殖情况,给与不同浓度(5μM、10μM、50μM、100μM、500μM和1000μM)BzATP作用于U87胶质瘤细胞24h,观察肿瘤细胞增殖情况,发现10μM BzATP可使细胞增殖率显著增加,100μM时U87胶质瘤细胞增殖率达高峰,P2X7受体阻断剂BBG及P2X7受体siRNA基因沉默可抑制BzATP所起促胶质瘤细胞增殖作用.在U251胶质瘤细胞可观察到相似结果.上述结果提示一定浓度的BzATP特异性激活P2X7受体可促进胶质瘤细胞增殖. (5)运用划痕实验检测胶质瘤细胞P2X7受体激活对细胞迁移的影响.正常U87胶质瘤细胞对照组迁移率为39.7±2.3%,BzATP(100μM,24h)处理组U87胶质瘤细胞迁移率为73.0±2.1%(P<0.001,t-test),BBG+BzATP组为53.0±6.6%(P=0.02,t-test).在U251胶质瘤细胞上观察到相似的实验结果. BzATP干预组的胶质瘤迁移率明显高于对照组,BBG及P2X7受体siRNA共培养可以消除BzATP的这一效应.这表明,BzATP激活P2X7受体提高胶质瘤细胞的迁移能力. (6)我们采用TUNEL法观察细胞凋亡情况.BzATP(100μM)作用于胶质瘤细胞24h,观察U87和U251胶质瘤细胞凋亡情况.与对照组相比,P2X7受体激活后U87和U251胶质瘤细胞凋亡率没有明显改变.可见胶质瘤细胞P2X7受体激活后对细胞的凋亡并没有明显的促进作用. (7)运用Western blot、MTT、划痕实验方法验证了ERK通路在P2X7受体激活诱导的胶质瘤细胞增殖、迁移中的作用.首先运用Western blot方法观察使用P2X7受体激动剂BzATP后胶质瘤细胞ERK/p-ERK蛋白表达情况.结果发现BzATP激活U87以及U251胶质瘤细胞上P2X7受体后,ERK、p-ERK以及PCNA蛋白表达均增加,即胶质瘤细胞P2X7受体激活后ERK、p-ERK表达均增强,并且PCNA蛋白表达也增强,表明EKR途径被活化.运用ERK途径的特异性抑制剂PD98059,采用MTT方法观察胶质瘤细胞增殖情况.结果显示PD98059阻断细胞ERK通路后,可抑制P2X7受体激活导致的胶质瘤细胞增殖率增加,表明ERK通路在P2X7受体激活介导的胶质瘤细胞增殖中发挥重要作用.采用划痕实验的方法观察PD98059对BzATP介导的胶质瘤细胞迁移促进作用的影响.结果显示PD98059阻断细胞ERK通路后,可抑制P2X7受体激活介导的胶质瘤细胞迁移率增加.上述结果表明ERK通路参与了P2X7受体激活诱导的胶质瘤细胞增殖、迁移这一过程. 综上所述,我们在不同级别的胶质瘤病理切片上发现,随着肿瘤分级的递增,P2X7受体荧光表达胶质瘤细胞阳性率呈增加的趋势.U87和U251胶质瘤细胞均有P2X7受体表达.体外特异性激活胶质瘤细胞P2X7受体,可促进胶质瘤细胞增殖、迁移.激活胶质瘤细胞P2X7受体对胶质瘤细胞凋亡无明显促进作用.激活胶质瘤细胞P2X7受体促进胶质瘤细胞增殖、迁移与细胞内的ERK通路活化有关.

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