NADP+依赖型甲酸脱氢酶的制备研究

摘要

氧化还原酶广泛应用于制药、精细化工品合成以及手性材料的生产等领域，且多数反应的完成需要烟酰胺辅酶NAD(P)H发挥作用。NADPH价格昂贵、重复利用率低，因此，需要构建合适的辅酶再生系统来解决此类问题。其中，甲酸脱氢酶(FDH)再生体系在所构建的酶偶联辅酶再生系统中经济效率最高，而NADP+依赖型甲酸脱氢酶是构建氧化态辅酶和还原态辅酶体系中的关键酶。因此，研究获取NADP+依赖型甲酸脱氢酶的方法具有重大的研究意义。本论文拟通过两种方式获取NADP+依赖型甲酸脱氢酶。 第一种方式是利用基因工程技术合成NADP+依赖型甲酸脱氢酶。实验以洋葱伯克氏霍尔德菌Burkholderia stabilis15516基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆得到ACF35003.1甲酸脱氢酶基因的全部序列，基因长度1161bp，编码386个氨基酸。以pET-17b为表达载体构建重组菌pET-17b-FDH，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达。实验设置一系列梯度实验研究产酶的最优条件以及酶学性质，结果表明，重组酶的最适诱导时机为接种后10h，最佳诱导时长为28h，IPTG最适浓度为0.5mM，酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH为6.0，最适pH范围6.0-9.0。温度范围在25-30℃时，重组酶对NAD+比活力受温度影响较小；温度范围在30-37℃时，重组酶对NADP+比活力受温度影响较小，热稳定性有待提高。 第二种方式是收集野生型NADP+依赖型甲酸脱氢酶。实验以植物根系周围的土壤为研究对象，采用定向筛选培养基TB-T和PCAT收集洋葱伯克氏菌群及近缘种，通过观察菌落形态生长，结合KOH溶液法以及革兰氏染色法，共分离到563株疑似菌。由于传统微生物分离法重复性高、工作量巨大、所需周期较长，相关工作还在进行中。 针对上述两种获取NADP+依赖型甲酸脱氢酶的方式，本实验分别建立了两种有效筛选NADP+依赖型甲酸脱氢酶的鉴定方法。鉴于野生菌样本数量多、菌种重复率高，采用微量显色筛选法能够快速、准确检测样品。对于重组菌则直接将其粗酶液加入酶活测试体系中，以紫外可见分光光度计测试OD600，计算出酶活。

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第一章 绪论

1.1辅酶再生的方法

1.1.1全细胞法

1.1.2光化学法

1.1.3化学法

1.1.4电化学法

1.1.5均相催化再生法

1.1.6多相催化再生法

1.1.7酶法

1.2甲酸脱氢酶的概述

1.2.1甲酸脱氢酶的分布及发现

1.2.2甲酸脱氢酶的分类及理化性质

1.2.3甲酸脱氢酶的氨基酸序列

1.2.5 NAD(P)+依赖型FDH主要的生产方法

1.3蛋白质工程

1.4本论文研究意义和研究内容

1.4.1研究意义

1.4.2研究内容

第二章 重组NADP+依赖型FDH的表达及酶学性质

2.1实验材料

2.1.1引物

2.1.2菌种和质粒

2.1.3实验试剂

2.1.4实验仪器

2.1.5培养基

2.2实验部分

2.2.1重组质粒pET-17b-FDH的构建

2.2.2菌种的活化与保存

2.2.3大肠杆菌感受态的制备

2.2.4转化

2.2.5 SDS-PAGE电泳

2.2.6重组菌生长曲线的测定

2.2.7产酶条件的优化

2.2.8重组菌pET-17b-FDH酶学性质的研究

2.2.9重组菌pET-17b-FDH的酶活测定

2.3结果与分析

2.3.1生长曲线

2.3.2产酶条件的优化

2.3.3重组FDH在大肠杆菌中的高效表达及优化

2.3.5重组菌pET-17b-FDH全细胞与粗酶液酶活比较

2.4本章小结

第三章 野生型NADP+依赖型FDH的筛选和鉴定

3.1实验材料

3.1.1实验试剂

3.1.2实验仪器

3.2实验方法

3.2.1样本的采集和处理

3.2.2培养基和生长条件

3.2.3菌株的分离和纯化

3.2.4 BCC菌的表型鉴定

3.2.5 NADP+依赖型FDH的筛选

3.2.6 NADP+依赖型FDH酶活测定

3.3结果与分析

3.3.1 BCC菌在各采集点的分布情况

3.3.2 BCC菌群的表型鉴定

3.3.3筛选方案的建立

3.4本章小结

第四章 结论与展望

4.1全文总结

4.2展望

参考文献

附录

致谢

硕士期间发表成果